对鳞翅目害虫有活性的cry1C基因的克隆和表达   总被引：2，自引：0，他引：2       下载免费PDF全文

宋福平  张杰  韩岚岚  高继国  黄大昉 《植物保护学报》2003,30(2):161-165

在鉴定苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)Btc001菌株cry基因型的基础上，构建了Btc001菌株质粒DNA HindⅢ片段的文库，并利用聚合酶链式反应-限制性酶切片段多态性(PCIR-RFIP)方法筛选出含有crylC6全长基因的13．5kb大片段，酶切分析得到该片段的物理图谱，BamHI和EcoRI切完成了6．5kb含全长基因的亚克隆，并对这条6．5kb片段亚克隆、测序，序列在国际核酸序列数据库(GenBank)登记(AY007686)，并由Bt杀虫晶体蛋白基因国际命名委员会命名为cry1Cb2基因。根据序列设计了一对用于扩增全长基因的引物S581CB和S381CB，扩增产物插入表达载体pET-21b中，诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达。表达产物对小菜蛾(Plutella xylostella)表现出较高活性，LC50达到7．9μg/ml。  相似文献   

菜豆普通花叶病毒长豇豆分离物外壳蛋白基因的序列分析及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

郑红英  陈炯  程晔  陈剑平  侯明生 《植物病理学报》2003,33(1):95-96

 根据普通生物学和血清学特性,长豇豆病毒病的病原被鉴定为黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaic virus,Bl CMV)、豇豆蚜传花叶病毒(Cowpea aphidborne mosaic virus,CABMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)。  相似文献   

秀丽纤杆线虫在寄生性线虫抗原研究中的应用     

韩春来  汪明 《中国兽医寄生虫病》2004,12(1):33-36

秀丽纤杆线虫 (Caenorhabditis elegans)是一种模式线虫 ,目前广泛应用于寄生性线虫基因的功能研究 ,并且还被用于捻转血矛线虫等寄生性线虫疫苗侯选抗原基因的表达和耐药性产生机制方面的研究  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株D971 mRNA3和mRNA4cDNA的分子特征   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘玉芬  刘胜旺  荣骏弓  孔宪刚  刘宝全 《中国兽医学报》2004,24(2):122-125

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)基因序列，设计合成了1对引物，经RT—PCR扩增得到了IBV国内分离株D971约1．3kb的片段，其中包含3a、3b、E及M蛋白基因的完整0RF，并将该片段进行了克隆和序列测定。与国内外部分IBV毒株序列比较表明：D9713a基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、GA／99和UK／66的3a基因核苷酸序列同源性在83％～89％之间，氨基酸序列同源性为77％～91％，其中与CU—T2毒株的同源性最低(分别为83％和77％)；3b基因与上述毒株的对应核苷酸序列同源性在85％～95％之间，氨基酸序列同源性为72％～96％，与CU—T2的同源性最高(分别为95％和96％)；E蛋白基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、Ark99、H52、Gray、GA／99和UK／66的核苷酸序列同源性在81％～86％之间，氨基酸序列同源性为74％～80％。不同毒株推导的E蛋白C末端表现不同特征，其中D971E蛋白C末端比CU—T2的时应区多9个氨基酸残基，而比本试验选用的其他参考毒株的相应区域短5～7个氨基酸残基。M基因与Cu—T2、DE072、Gray、M41、H120、H52、SD／97／02、LX4及D41的M基因核苷酸序列同源性在86％～91％之间，氨基酸序列同源性为85％～95％，其中与SD／97／02的同源性最高(分别为91％和95％)。对M蛋白的3个功能区进行序列比较发现，其N端第1～19位与SD／97／02的同源性最高，达90％，与CU—T2的同源性为80％，而与其他毒株同源性均低于61％；N端第20～100位含有3个跨膜蔬水区，D971与其他参考毒株比较，该部位第20～67位相对保守，其中与SD／97／02的同源性为100％，与其他毒株的同源性在97％以下；在推测的与核衣壳连接的C端，D971与SD／97／02在第101～182位同源性为100％，与疫苗株H52和H120及国内分离株LX4和D41的同源性为97％，而与本试验所选的国外参考毒株同源性在96％以下；在C端第184～219位D971与H52的同源性为100％，与H120和SD／97／02的同源性为97％，与其他毒株的同源性也在96％以下，而且在C末端第220～222及224位与上述国内外参考毒株均不同，国内外各毒株在该4个位点氨基酸为丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸，而D971M蛋白的该区域氨基酸突变为丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸，该突变是否与D971的生物学特性尤其是组织嗜性的变化相关还有待于进一步研究。以上结果表明，D971与SD／97／02亲缘关系较其他毒株为近，但其遗传衍化又与国内使用的疫苗株H52和H120具有一定的联系。从其mRNA3和mRNA4cDNA的序列分析来看，D971又具有独特的分子特征。  相似文献   

鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化   总被引：2，自引：0，他引：2  

贺云霞  王君伟  王立群  Ulrich Neumann 《中国兽医学报》2004,24(2):126-128

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。  相似文献   

家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化   总被引：4，自引：0，他引：4  

施振旦  邵西兵  方梅霞  于迎春  刘颖  陈楠 《中国兽医学报》2004,24(3):258-260

从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m g左右  相似文献   

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达   总被引：3，自引：0，他引：3  

宫强  刘思国  王牟平  王春来  彭永刚  沈国顺 《中国兽医学报》2004,24(4):340-342

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础  相似文献   

鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用   总被引：4，自引：0，他引：4  

孙蕾  吴艳涛  张体银  陈素娟  刘秀梵 《中国兽医学报》2004,24(5):429-432

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制 ,具有广阔的应用前景  相似文献   

鼠层粘蛋白α5链E3、LG4、LG5片段的克隆及表达     

孙兆增  张玉静  展德文  张艳宇  连继勤 《中国兽医学报》2004,24(5):467-469

从鼠的肝脏组织中提取总 RNA,采用 RT- PCR获得了鼠层粘蛋白 ( laminin)α5链的 E3 ( L G4 - 5)、L G4 和 L G5等 3个基因片段 ,与 NCBI数据库参考序列相比 ,同源性在 99%以上。将 E3 ( L G4 ,5)、L G4 和 L G5定向克隆到原核高效表达载体 Pet- 2 8a中 ,构建 Pet- 2 8a- E3 、Pet- 2 8a- L G4 、Pet- 2 8a- L G5等 3个原核表达质粒。将表达质粒转化表达受体菌 BL2 1中 ,IPTG诱导表达。收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western- blotting分析 ,结果显示 ,这 3段基因在原核细胞中成功表达 ,薄层扫描显示表达蛋白占细胞总蛋白的 2 0 %以上。大量提取包涵体 ,纯化后免疫家兔 ,8周后得多克隆抗体 ,间接 EL ISA在抗体稀释到 1∶ 1 2 80 0时仍为阳性  相似文献   

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因缺陷型菌株的筛选     

孙哲  王春凤  汪明 《中国兽医杂志》2004,40(2):12-14

本研究以大肠杆菌(含有β半乳糖苷酶基因)为试验对象，用氮-甲基-氮硝基氮-亚硝基胍对其进行诱导突变，在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变，筛选到了β-半乳糖苷酶基因缺陷型的大肠杆菌受体菌株，从而为构建以β-半乳糖苷酶基因为选择标记的载体表达系统奠定了基础。  相似文献