利用正交设计优化黄瓜的SSR-PCR反应体系   总被引：4，自引：0，他引：4  

李亚利  陈书霞  孟焕文  程智慧  柴丹丹 《西北农业学报》2008,17(3):280-284

以白皮黄瓜B-2-2为试材,采用正交设计L16(45)在4个水平上对影响黄瓜SSR-PCR反应体系的Taq酶浓度、Mg2 含量、模板DNA用量、dNTP浓度及引物用量等5个因素进行了试验优化,并用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平,建立了黄瓜SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:在20μL反应体系中,Taq酶最适浓度为0.5U,Mg2 最适浓度为2.0 mmol/L,模板DNA最适用量为5 ng/μL,dNTP最适用量为0.2 mmol/L,引物最适浓度为0.6μmol/L;引物最佳退火温度为50.0℃。利用20个黄瓜材料验证此反应体系,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100~300 bp之间多态性高,且反应体系的稳定性和重复性好。  相似文献   

菟丝子RAPD反应体系的建立和优化   总被引：3，自引：0，他引：3  

郭琼霞  黄可辉  庄蓉  黄振  虞赟  沈建国 《江西农业学报》2008,20(5):21-24

以南方菟丝子基因组DNA为试材,采用单因素递进筛选方法对菟丝子的RAPD反应体系进行了优化。结果表明,在25μL总反应体积中,最佳浓度配比为：模板DNA 20 ng,MgC l23.0 mmoL/L,引物10μmoL/L,dNTP 400μmoL/L,TaqDNA聚合酶1个单位（U）,10×反应缓冲液2.5μL。扩增程序为：94℃变性3 m in,再进入循环;94℃变性1 m in,40℃退火1m in,72℃延伸1 m in,共40个循环;72℃最终延伸10 m in,于4℃保存。  相似文献   

长柱金丝桃ISSR-PCR反应体系的建立与优化     

王丽俊  王霞 《东北林业大学学报》2017,45(10)

为筛选可用于长柱金丝桃遗传分析的最适ISSR-PCR反应体系,采用正交试验对影响ISSR-PCR反应的5个重要因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg~(2+)、引物和模板DNA浓度)进行4水平正交优化,并对退火温度、循环次数进行筛选。结果表明,20μL ISSR-PCR最佳反应体系包括Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、Mg2+3.0 mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、DNA模板40 ng,对ISSR-PCR反应的影响程度由大到小为:Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTPs、DNA模板;引物UBC822的最佳退火温度52.7℃,最佳循环次数41,利用优化的反应体系从61条引物中筛选出12条稳定性好、多态性高的引物,验证试验表明优化的反应体系具有较高的稳定性。  相似文献   

3种实蝇基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的建立          下载免费PDF全文

余德亿姚锦爱  胡进锋黄鹏  方大琳陈峰 《农学学报》2011,1(3):22-28

为探讨高品质实蝇基因组DNA提取,研究模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、退火温度及时间对ISSR-PCR扩增结果的影响,以3种实蝇为材料,建立通用且稳定的实蝇ISSR-PCR反应体系。结果表明：获得了高品质实蝇基因组DNA;确立了通用且稳定的实蝇ISSR-PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL,模板DNA 50 ng,引物0.25 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.50 U,dNTP 200 μmol/L,最后加ddH2O至25 μL;明确了ISSR-PCR扩增程序：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52.4℃退火45 s,72℃延伸90 s,循环36次,最后72℃延伸7 min,4℃保存。体系的建立弥补了实蝇传统形态检测的不足,为快速准确鉴定、种群异质性及遗传多样性分析奠定了基础。  相似文献   

东北红豆杉RAPD反应体系的优化   总被引：1，自引：0，他引：1  

肖璐  许明子  崔苗  刘博 《农业科学与技术》2010,11(3)

[目的]研究东北红豆杉RAPD反应体系的优化条件.[方法]以东北红豆杉叶片为材料,用改进CTAB法提取DNA,分别从模板DNA浓度(10、20、30、40、50 ng)、引物浓度(5、10、15、20、25 pmol/μl)、dNTP浓度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L),Taq DNA聚合酶量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U)及镁离子浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)5个方面对东北红豆杉RAPD扩增效果的影响进行分析.[结果]用改良的CTAB法提取红豆杉基因组DNA,所得DNA质量较好,无杂质存在,条带整齐一致,而且能够取得比较理想的RAPD扩增效果.通过各因子的比较分析,建立了东北红豆杉RAPD优化体系:20 μl PCR反应总体积中含模板DNA 10 ng,Mg2+ 2.0 mmol/L,引物15 pmol/μl,dNTP 0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,10×buffer缓冲液2 μl,以双蒸水补充至20 μl.[结论]为进一步探索与东北红豆杉性别鉴定相关的研究提供技术支持.  相似文献   

蕙兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（英文）   总被引：1，自引：0，他引：1  

汤秀菲  孙小琴  彭德镇  杨柏云 《农业科学与技术》2010,(11):103-106

[目的]以蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行筛选和优化,建立适合蕙兰的ISSR-PCR的最佳反应体系。[方法]利用改良的CTAB法提取蕙兰基因组DNA,并对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行优化。[结果]获得了高质量的蕙兰基因组DNA并建立了最适的蕙兰ISSR-PCR体系（25μl）,即2.5μl10×PCRbuffer,2.0mmol/LMgCl2,60ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.85μl;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,复性温度比引物的Tm值低2～3℃,30s,72℃延伸50s,40个循环;72℃延伸7min。[结论]该优化体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行蕙兰遗传多样性研究提供依据。  相似文献   

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化   总被引：6，自引：3，他引：3  

王康  董宽虎  孙彦  康俊梅  董洁  孟林 《草地学报》2008,16(6):580

根据正交试验设计原理,设计探索正交试验和细调正交试验以确定马蔺(Iris lacteal Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz)ISSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg²⁺4种因素对马蔺ISSR反应体系进行了优化,得到适合马蔺的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有dNTP 0.3 mmol/L、Taq酶1.5 U、Pri mers 0.4μmol/L、Mg²⁺2.5 mmol/L以及1×buffer和50 ng模板DNA。通过对马蔺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为52℃。这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究马蔺遗传多样性奠定了基础。  相似文献   

基于PCR及焦磷酸测序技术的单孢子虫鉴定技术研究与应用          下载免费PDF全文

王彩霞  林祥梅  邓俊花  吴绍强 《渔业科学进展》2011,32(5):92-96

为适应口岸单孢子虫快速、准确、高通量检测的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的单孢子虫鉴定方法。以OIE推荐的PCR扩增方法获得单孢子虫特异基因,根据此基因的保守序列利用焦测序软件PyroMarkQ96ID设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析确定为单孢子虫序列。同时采用PCR焦磷酸测序方法和OIE推荐的PCR方法对牡蛎样品进行检测。结果表明,所建立的检测方法可从基因序列水平上准确鉴定牡蛎样品中的单孢子虫,且检测结果与OIE方法的检测结果一致。  相似文献   

锦鲤疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立   总被引：4，自引：0，他引：4  

张艳  孟庆峰  钱爱东  王伟利 《吉林畜牧兽医》2010,31(4):11-14

根据锦鲤疱疹病毒(KHV)胸苷激酶(TK)基因的保守序列设计一对引物和相应的TaqMan探针,建立荧光定量PCR方法,用于锦鲤疱疹病毒快速、灵敏、可定量的检测手段。构建并制备实时荧光定量PCR的标准品,对反应体系进行优化,并做特异性,敏感性和重复性试验。结果表明,成功构建荧光定量PCR标准品,建立荧光定量标准曲线,标准曲线的相关系数为0.992,所建立的荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,重复性好。  相似文献   

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析   总被引：4，自引：0，他引：4  

王勤  郭万柱  徐志文  汪铭书  王小玉 《畜牧兽医学报》2003,34(4):389-393

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。  相似文献