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果胶酯酶(pectin methylesterase,PME)催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化,可以降解植物细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关。本研究根据白梨果胶酯酶基因PcPME4的序列,设计一对含有特定酶切位点的特异性引物,以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)cDNA为模板通过PCR扩增得到一段294bp的PME基因片段。将片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建PME基因的反义表达载体pBI121-AsPME。将pBI121-AsPME电转化农杆菌EHA105,利用含pBI121-AsPME的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后于抗性培养基中诱导愈伤组织,获得的抗性愈伤组织经PCR初步检测含有反向PME基因片段,荧光定量PCR检测结果显示受侵染的愈伤组织中PME基因表达量降低,表明反向插入的PME基因片段起到了抑制内源基因表达的效果。 相似文献
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[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据. 相似文献
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根据已克隆到的Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1cDNA全长基因Lg-mnp1,在5’端设计了3个巢式特异性引物,利用染色体步移技术克隆得到了其上游1 568 bp的启动子序列。采用Signal Scan进行了启动子序列分析。结果表明,在起始密码子上游-92～-43 bp区域为Lg-mnp1启动子的基础启动子区;在-52 bp处有一个转录起始位点,-83 bp处有1个TATAAA-box,-119、-196 bp有2个反向CCAAT-box(ATTGG)。启动子区也存在多个顺式作用元件,包括转录因子SP-1(GGGCGG)、转录因子AP-2(CCCMNSSS)、热激元件HSE(NTTCNNGAAN)及6个推定的金属响应元件MRE(TGCRCNC)等。 相似文献
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采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基用4种不同的底物处理方式,对白腐菌偏肿栓菌在28℃下进行静止培养,得到不同时间内的培养液,用紫外可见分光光度计分别检测在470,420,310nm处对于2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、藜芦醇(VA)的氧化作用后光密度值的变化情况,作为其木质素降解酶系统锰过氧化物酶(MnP)、漆酶和木质素过氧化物酶(LiP)产生的依据。结果表明:偏肿栓菌可产生MnP(必须在Mn2+存在的条件下)和漆酶(不依赖于Mn2+),但不产生LiP;在培养液内添加底物木屑和2,6-DMP后可显著提高2种酶的分泌量。在此基础上,用含Mn2+和青杨木屑的LNAS培养基对偏肿栓菌在30℃下静止培养作为初始培养条件,然后采用2次正交试验和多种单因素试验对偏肿栓菌产MnP的培养基组分和培养条件进行优化。结果表明:在试验设定的因素和水平范围内的最优组合是培养液果糖浓度为5g.L-1、酒石酸铵浓度为15mmol.L-1、锰离子浓度是200μmol.L-1、吐温-80浓度为0.25mL.L-1,MgSO4.7H2O浓度为0.35g.L-1、矿质... 相似文献
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【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906268.1;PbPAL2 cDNA序列全长为2 387 bp,含2 163 bp完整开放阅读框、14 bp的5′非翻译区及210 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906269.1。系统进化分析表明PbPAL1和PbPAL2位于分子进化树的不同分支,PbPAL1与西洋梨（Pyrus communis）的PAL同源性较高,而PbPAL2与桃（Prunus persica）的PAL同源性较高。定量PCR分析表明,随着鸭梨果实发育成熟,果皮、果肉和果心的PbPAL1和PbPAL2表达量各异,但均呈下降趋势;且果实发育早期果心中的PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉。损伤处理可迅速诱导鸭梨的果肉褐变,果皮褐变出现较晚;同时,损伤刺激果皮和果肉组织中PbPAL1和PbPAL2表达上调。果皮中PbPAL1表达量在损伤处理后6 h达到高峰,而PbPAL2在损伤处理后48 h才显著上升;果肉中PbPAL1在损伤处理后1 h表达量开始显著上升,而PbPAL2在损伤处理后12 h才显著上升。【结论】鸭梨PbPAL1和PbPAL2属于2个不同的PAL类型,其表达随果实发育呈下降趋势,机械损伤过程中,两基因表达显著上调,表明其参与了损伤引起的组织褐变过程。 相似文献
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应用双水相萃取技术在PEG15％、K2HPO410％条件下,对苏云金杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）和苏云金亚种（Bacillus thuringiensis subsp．thuringiensis）β-外毒素进行分离和初步纯化,提取纯化的β-外毒素用紫外分光光度计检测,同时进行了热稳定性试验、生物活性检测和生物毒性检测。结果表明：菌种1．1751在15％PEG和10％K2HPO4的双水相分离系统中具有较好的分离效果,采用两水相萃取技术可以分离得到较高浓度的β-外毒素,而且β-外毒素保持良好的活性。 相似文献
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【目的】从鸭梨中克隆GAPDH基因家族,筛选合适的鸭梨内参基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆鸭梨GAPDH基因家族,用半定量PCR方法分析4个鸭梨GAPDH基因在鸭梨幼叶、花蕾、盛花期花瓣、幼果期果肉和成熟期果心,以及幼果期、膨大期、成熟期和褐变期果心的表达特征。【结果】从鸭梨中成功克隆出了4个GAPDH基因,分别命名为PbGAPDHa、PbGAPDHb、PbGAPDHc1和PbGAPDHc2。其中PbGAPDHa和PbGAPDHb是由一个共同的祖先基因倍增进化来的,主要在鸭梨的幼叶中表达,其蛋白定位在质体;而PbGAPDHc1和PbGAPDHc2是一个基因的2种拷贝形式,在鸭梨的花、幼叶、果实等组织中表达量基本一致,在不同发育时期的果心中表达量也相近,其蛋白定位在细胞质。【结论】PbGAPDHc1和PbGAPDHc2适合作为鸭梨的内参基因。 相似文献
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近年来,CRISPR/Cas系统因其简易性和有效性不仅在植物基因组编辑中得到广泛应用,而且开始应用于植物抗病毒研究。本文介绍了CRISPR/Cas系统的研究进展,详述了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13a在抗植物病毒中的应用,以及靶向病毒基因组和靶向宿主植物基因组两种抗病毒基本策略;同时讨论了CRISPR/Cas12a和相关原核Ago系统在抗植物病毒上的潜在应用前景,并指出CRISPR/Cas在应用中存在的挑战。由于CRISPR/Cas系统在抗植物病毒研究中的优势,可能给植物抗病毒育种带来革命性变化。 相似文献