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白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。 相似文献
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[目的]研究偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况.[方法]根据白腐菌锰过氧化物酶（MnP）基因保守序列设计引物,采用PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因（GenBank登录号JQ327834）,进行蛋白序列分析,并通过双酶切的方法获得重组质粒,将该重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母中进行异源表达.[结果]获得偏肿革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全长MnP1基因,命名为Lg-mnp1.蛋白序列分析表明Lg-MnP1含有4个二硫键属于短MnP,预测成熟蛋白分子量为35.94kD,pI为4.43.通过双酶切的方法将Lg-mnp1的开放阅读框（ORF）序列连接到pPICZB载体上,获得重组质粒pPICZB/%-mnp1,转化子经PCR验证后,在BMMY培养基中甲醇诱导培养,在未添加血红素的培养液中MnP胞外酶活在72 h达到最高为7 U/L,表明Lg-mnp1已被转化至毕赤酵母中并可诱导表达.[结论]该方法对偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的克隆及表达情况进行研究,为偏肿革裥菌Lg-mnp1基因的进一步应用提供了依据. 相似文献
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根据已克隆到的Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1cDNA全长基因Lg-mnp1,在5’端设计了3个巢式特异性引物,利用染色体步移技术克隆得到了其上游1 568 bp的启动子序列。采用Signal Scan进行了启动子序列分析。结果表明,在起始密码子上游-92～-43 bp区域为Lg-mnp1启动子的基础启动子区;在-52 bp处有一个转录起始位点,-83 bp处有1个TATAAA-box,-119、-196 bp有2个反向CCAAT-box(ATTGG)。启动子区也存在多个顺式作用元件,包括转录因子SP-1(GGGCGG)、转录因子AP-2(CCCMNSSS)、热激元件HSE(NTTCNNGAAN)及6个推定的金属响应元件MRE(TGCRCNC)等。 相似文献
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