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试验旨在通过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1（MUC-1）、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白（Wnt-7a）、β受体1（IFNAR1）、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化（P>0.05）;浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）,细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组（P<0.05）,引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加（P<0.01）;Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降（P<0.01）;Integrin αvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降（P<0.01）,蛋白相对表达量均显著下降（P<0.05）。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。 相似文献
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FSH对绵羊卵母细胞体外核成熟的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
为了探讨FSH对绵羊卵母细胞核成熟的影响,本试验将绵羊卵母细胞体外成熟24 h,并在成熟过程中的4个不同时间段内添加FSH,统计各个时间段卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle break down, GVBD)及第一极体排出情况。结果显示：①在体外成熟培养的前4 h或前8 h添加FSH,经体外成熟的卵母细胞其生发泡破裂率与不添加FSH组无显著差异;②在体外成熟的4~24 h或8~24 h添加FSH,其第一极体排出率与不添加FSH组有极显著差异。说明,在本试验条件下,FSH对绵羊卵母细胞体外成熟具有显著的促进作用,是在减数分裂的恢复后到减数分裂完成之间的某一阶段起的促进作用。 相似文献
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肝素浓度和作用时间对绵羊精子体外获能和体外受精的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
摘 要：通过研究添加不同的肝素浓度(0、5、10、20、50μg/ml)及不同作用时间（0、30、45、60、90、120min）对绵羊精子体外获能、存活时间和相应体外受精的影响,为改善绵羊精子体外获能效果及研究获能的机理提供一定的参考。在获能液中添加10μg/ml肝素作用45min时,其获能率最高,顶体反应率最低（40.92％和16.59％）（P<0.05）,存活时间18h,能够提高受精卵的囊胚发育;单独使用咖啡因或与10μg/ml肝素联合使用,其获能效果均不如单独使用10μg/ml肝素。说明绵羊精子获能时肝素的适宜浓度是10μg/ml,作用时间是45min,咖啡因无协同肝素促进获能的作用。 相似文献
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奶牛子宫炎性腔液外泌体小RNA分布和组成分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】筛选奶牛子宫内膜炎诊断新型标志。【方法】采用贝博试剂盒分别从健康奶牛、患子宫内膜炎奶牛的子宫腔液中分离外泌体,透射电子显微镜检测外泌体形态和粒径大小,蛋白免疫印迹法检测外泌体蛋白标记CD9的表达,Trizol提取外泌体内RNA,Agilent 4200生物分析仪检测RNA的分布与组成。【结果】透射电子显微镜下奶牛子宫腔液外泌体呈囊泡形,有完整的膜结构,粒径大小为50～150nm之间;蛋白免疫印迹法检测到外泌体内均有CD9表达;生物分析仪检测显示子宫内膜炎症改变了子宫腔液内小RNA长度分布和组成。【结论】子宫腔液中小RNA变化可以作为奶牛子宫内膜炎症诊断的新型标志。 相似文献
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冷冻速率和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
为优化冷冻和解冻方法,提高冷冻效果,本试验比较了不同冷冻速率(-100 ℃ 10 min、-120 ℃ 10 min、-140 ℃ 10 min)和不同解冻温度(37 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s)对猪精液冷冻效果的影响。结果表明,采用-120 ℃熏蒸10 min,解冻后精子活力为0.36,质膜完整率和顶体完整率也优于其他2组,且差异显著(P<0.05)。采用37 ℃ 30 s方法解冻,精子活力、质膜完整率显著高于其他3组,顶体完整率也高于其他3组,但差异不显著(P>0.05),其畸形率最低和60 ℃ 30 s组差异明显(P<0.05),但与45 ℃ 30 s组和52 ℃ 30 s组差异不显著(P>0.05)。因此,采用-120 ℃平衡10 min冷冻,37 ℃ 30 s水浴解冻方法更为适合0.25 mL细管猪冻精解冻。 相似文献
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转TLR4基因的绵羊胎儿成纤维细胞系的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为了通过脂质体介导的方法获得高效表达目的基因TLR4的绵羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,以便在胚胎移植前的体外筛选过程中,确定优越的转基因供体细胞,从而提高体细胞核移植生产抗病转基因绵羊的效率。本研究通过优化脂质体与质粒载体的比例浓度,进而再去转染原代培养的绵羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选,以EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein )作为报告基因,从形态学与分子水平鉴定出已经稳定表达目的基因：Toll样受体4(Toll Like Receptor4,TLR4)基因的细胞系。最终经过筛选与纯化得到3个表达目的基因TLR4的细胞克隆,经RT-PCR与相对荧光定量PCR分析,在第二代转染的细胞中TLR4的表达最高,相对于未转染的绵羊胎儿成纤维细胞升高了9.65倍(P<0.01),并藉此为最终制备抗病转基因羊新品种,从提供稳定表达TLR4基因的转基因供体细胞系角度奠定基础。 相似文献
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影响绵羊胞质内单精子注射结果相应因素的分析 总被引：1，自引：1，他引：0
本实验探讨了绵羊卵母细胞成熟以及胞质内单精子注射的相应影响因素,以期优化绵羊ICSI的操作技术和体外成熟体系。本研究分别设定三组卵母细胞成熟时间（19~21h,23~25h,
28~30h）,同时比较“6”, “12”点和“7”, “11”点注射位置对胞质内单精子注射后胚发育的影响。结果表明,绵羊卵母细胞在成熟23~25h之间进行单精子注射后,其囊胚率显著高于19~21h和28~30h(6.30±0.59%vs 4.05±0.63%,3.59±0.29),研究注射位置对胚胎发育影响时研究结果显示,在“6”, “12”点注射后其胚胎的卵裂率（54.17±3.24 vs 46.40±3.22%）和囊胚率（5.88±0.30 vs 2.77±0.15）均明显高于“7”, “11”点。因此,实验表明,应尽量使用成熟23~25h的绵羊卵母细胞进行胞质内单精子注射,同时注射时应选择“6”, “12”点的位置,从而利于胚胎的后期发育。 相似文献
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【目的】对前期获得的3头转基因牛进行分子生物学评价,包括转基因阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,旨在进一步为转基因牛的安全评价提供一些科学依据。【方法】根据GenBank上公布的牛FABP4基因（GenBank登录号：NM_174314）mRNA序列,利用兼并密码子对现有FABP4基因进行突变,并构建了pEGFP-C1-FABP4真核表达载体、通过细胞转染、体细胞核移植、胚胎移植技术获得3头转基因牛;分别采集了1号转基因牛不同组织样,2、3号转基因牛与野生型个体8、10、12、14月龄的血液样本,利用RT-PCR技术对所获转基因个体的阳性与否进行了鉴定;同时利用荧光定量PCR技术检测了1号转基因牛不同组织中外源性FABP4基因的表达情况,并分析了2、3号转基因牛在8-14月龄之间,外源性FABP4基因、内源性FABP4基因的变化趋势,并通过叠加转基因牛外源与内源性FABP4基因的表达量,分析了转基因牛和非转基因牛FABP4基因的整体表达水平差异;通过Western blotting技术分析了3头转基因牛外源性FABP4基因的蛋白表达水平。【结果】①对所获得的3头转基因牛RT-PCR检测发现,3头转基因个体各样本均在205 bp处产生条带,而妊娠母牛及阴性对照在205 bp处均未有条带出现,初步表明3头转基因牛均为转基因阳性。②实时定量PCR检测表明,1号转基因牛的外源性FABP4基因在多数组织均有较高表达,其中脂肪组织表达量最高、肾脏和背最长肌次之,肺部的相对表达量极低。3号转基因牛外源性FABP4基因的表达水平高于2号转基因牛,且2、3号转基因牛外源性FABP4基因的表达水平随月龄变化均呈现先上升后下降趋势;在内源性FABP4基因表达水平检测中发现,外源性FABP4基因的转入抑制了转基因牛体内内源性FABP4基因的表达,且随月龄变化转基因牛体内内源性FABP4基因表达水平均呈现上升趋势;野生型牛内源性FABP4基因的表达水平随着月龄变化逐步下降,而转基因牛体内内源性FABP4基因的表达量均低于野生型牛;通过对2、3号转基因牛外源与内源性FABP4基因相对表达量的叠加分析发现,转基因牛FABP4基因整体表达量较野生型大幅升高。③蛋白表达检测结果与mRNA检测结果基本一致,外源性FABP4基因在1号转基因牛除肺部外的各个组织均检测到外源FABP4基因的蛋白表达,其中背最长肌表达量最高;3号转基因牛蛋白表达水平高于2号转基因牛。【结论】获得的3头牛均为FABP4阳性转基因牛,且外源性FABP4基因在体内能够正常表达,转基因牛FABP4表达量较野生型大幅升高,同时外源性FABP4基因的转入抑制了内源性FABP4基因的表达。 相似文献
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【目的】研究促黄体素（LH）对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。【方法】将绵羊卵母细胞置于含LH（处理组）或不含LH（对照组）的成熟液中进行体外成熟,在不同时间点取出,观察卵母细胞核成熟情况;结合皮质颗粒分布变化的观察结果判断细胞质成熟情况。【结果】绵羊卵母细胞体外成熟4 h时,处理组生发泡破裂（GVBD）率显著低于对照组（36.76% vs 50%,P＜0.05）;体外成熟24 h并进行体外受精后,处理组卵母细胞卵裂率和囊胚率显著高于对照组（67.15% vs 42.37%,21.9% vs 12.71%,P＜0.05）。激光共聚焦扫描检测结果表明,随着核的成熟,绵羊卵母细胞的皮质颗粒由胞质中心区域向周边发生规律性迁移,经LH处理的卵母细胞,皮质颗粒扩散的程度明显好于对照组。【结论】LH可能通过延迟生发泡破裂和促进胞质成熟的方式,使绵羊卵母细胞的核质成熟趋于同步,有助于绵羊卵母细胞的体外成熟以及受精后的进一步发育。 相似文献