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马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株，对马和驴均可100％致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因，将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上，命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞，连续盲传3代并以反转录酶活性测定，RT-PCR鉴定其病毒活性，透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子，证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子，命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分子克隆，将此克隆病毒接种驴，可以引起典型的马传贫症状并导致试验动物死亡。该分子克隆的建立为进一步考察病毒的毒力与基因的关系提供了良好的平台。 相似文献
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马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)是逆转录病毒科慢病毒属的成员之一，其基因组结构与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human innunodeficiency virus type 1，HIV-Ⅰ)相似。马传染性贫血呈世界性分布，常引起慢性感染，以发热、贫血为特征，耐过马呈隐性感染并终身带毒。20世纪70年代初期，Coggins博士建立了检测感染马血清抗体的琼脂扩散试验(AGID)，成为检测EIA的标准方法。 相似文献
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恶臭假单胞杆菌转谷氨酰胺酶基因的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)H76的转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)基因,然后将扩增的约800bp的基因片段克隆到pET-28a( )表达载体上,构建重组TGase的表达载体.酶切鉴定阳性的重组质粒命名为pET-TGase.核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与恶臭假单胞杆菌KT2440的相应基因有很高的同源性.该载体的构建为进一步研究转谷氨酰胺酶的生物学功能以及应用提供了基础. 相似文献
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牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
经DNAstar分析，据牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）全基因序列设计合成gB基因的特异性引物，以构建的pGM-T-gB为模板，PCR扩增IBRVgB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆，酶切鉴定并测序鉴定后，定向插入pET32a表达载体中，转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明，诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在，大小约为29．2ku，与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2．000mg／mL，纯度为79．2％。间接ELISA检测证明，表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原，建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50／zg／mL，血清的最佳稀释度为1：40，阳性标准定为s／e〉0．395。交叉试验表明对牛流热（BEV）、牛肺疫（CBPP）、牛病毒性腹泻（BVD）、牛结核（BTB）、牛副结核（PBB）以及牛赤羽病（BAD）等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较，特异性、敏感性和符合率分别为83．3％、90．9％和88．9％；与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较，特异性、敏感性和符合率分别为92％、92．7％和92．5％。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景。 相似文献
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为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）BA株接种MDBK细胞，提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列，利用Oligo6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物，引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T载体上，酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，并用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后，用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性，为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。 相似文献
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本试验对马传贫血清抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)的耐热性进行了比较研究.对2匹弱毒疫苗免疫马跟踪检测17个月,在接种3周后ELISA检测均呈阳性,其中一匹马ELISA抗体阳性持续到接种后10个月,另一匹马ELISA抗体阳性可持续到接种后一年.对两匹马的所有不同时期采集的血清样品经75℃加热5 min处理后,用ELISA检测均为阴性.另选6匹马传贫弱毒疫苗免疫马血清且ELISA检测抗体呈阳性的30个样品,经75℃加热5min处理后,均由阳性转变成阴性.4匹经马传贫病毒辽毒株(LN-EIAV)实验感染马且ELISA检测抗体呈阳性的血清样品,经75℃加热5 min处理后,结果仍为阳性.23匹ELISA检测抗体呈阳性的自然感染马血清样品,经加热处理后,19匹马血清样品仍为阳性,4匹马血清样品由阳性转变成阴性.结果表明弱毒疫苗免疫马较自然感染马血清抗体耐热性稍差. 相似文献
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牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达 总被引：6，自引：0，他引：6
以牛传染性鼻气管炎病毒Baaha Nu/67株的DNA作为模板，用PCR扩增gE基N并克隆至pGEM-T Easy裁体，再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段，分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达，1个片段以包涵体形式表达，另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验，间接ELISA和交叉试验证明，两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应，而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应，显示其具有良好的抗原性和特异性，可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。 相似文献
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为了检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),根据已发表的融合蛋白(F)基因序列,设计了套式RT-PCR引物,初步建立了BRSV的套式RT-PCR检测方法。对138份牛鼻腔棉拭子进行了检测,结果检测到了BRSV阳性样品54份,总的阳性检出率为39.1%。对大部分BRSV阳性样品的F基因扩增产物进行了序列测定与分析。用该套式RT-PCR对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒等进行了检测,结果无交叉反应,表明该检测方法具有良好的特异性。本研究首次用套式RT-PCR技术证实了我国部分省的牛群中存在BRSV感染。 相似文献