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【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒为研究对象,探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌（pBAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns）的生长曲线,比较hns对菌株的影响情况;分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌,大肠埃希菌J53（耐叠氮钠）为受体菌,进行接合试验,并计算接合频率;采用实时荧光定量PCR检测各重组菌（F25922、FΔhns和FΔhns/phns）中IncFⅡ质粒接合转移相关基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量;构建LacZ融合报告菌株F25922/PM（PJ/PY）、FΔhns/PM（PJ/PY）和FΔhns/phns/PM（PJ/PY）,分别测定不同菌株中3种基因（traM、traJ和traY）启动子PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性;构建H-NS蛋白原核表达载体,采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白,PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列,利用电泳迁移率变动分析试验（EMSA）探明核蛋白H-NS调控IncFⅡ质粒接合作用的调控方式,预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和pBAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异,说明质粒pBAD和IncFⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长;但是,缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922,表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差,但不影响菌株的存活。接合试验结果显示,FΔhns中IncFⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1 279.33倍（P<0.001）,而FΔhns/phns中IncFⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平,但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示,FΔhns中tra基因（traM、traJ和traY）的mRNA表达量均极显著高于对照菌株（P<0.001）,其中traJ的mRNA表达量最高,为F25922的1 510.14倍,其次为traY和traM,表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍,而回补株FΔhns/phns中不同基因的mRNA表达量均极显著低于FΔhns,与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,缺失报告菌株FΔhns/PM（PJ/PY）中PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91,均极显著高于对照菌F25922/PM（PJ/PY）的相应启动子（P<0.001）,而回补报告菌株FΔhns/phns/PM（PJ/PY）中PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/PM（PJ/PY）,且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对IncFⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示,H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移,说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合;通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证,证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与IncFⅡ质粒的traM、traJ和traY的启动子区的AT富集区结合,抑制启动子活性,从而导致启动子下游相关转移基因traM、traJ和traY的表达量下降,结果明显抑制IncFⅡ质粒的接合转移。 相似文献
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通过对鸡志贺氏菌β-内酰胺酶及ESBLs的测定、质粒提取、细菌转化及质粒结合转移等试验,分析其耐药性与其质粒之间的关系,探讨耐药质粒在细菌间的传递方式.结果表明,质粒转化后的转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖苷类、氟诺酮类有一定程度的敏感;而质粒接合传递体的耐药谱与质粒转化子一致.耐药菌株的质粒可编码β-内酰胺酶,且耐药质粒可通过结合转移方式传递至感受态大肠杆菌. 相似文献
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利用高分子材料制备固体分散体是当前最有效最便捷的改变非水溶性药物的水溶解度和生物利用度的方法之一。为探究临床常见药用高分子材料载体的优越性和差异性,利用聚乙二醇(PEG)6000、PEG4000、聚维酮(PVP)k30、PVPk15、泊洛沙姆188等高分子材料为载体,采用熔融法、溶剂法和溶剂熔融法制备氟苯尼考固体分散体,溶出速率法验证固体分散体,比较氟为尼考原料、物理混合物及固体分散体的溶解度和累积溶出率。结果表明：几种固体分散体均可提高氟苯尼考药物的溶解度和体外溶出速率,其增溶效果为PEG6000>PEG4000>PVPk30>PVPk15>188,氟苯尼考与PEG6000配比在1∶4时溶解度和体外溶出速率均最优,是最佳配比。5种不同高分子材料制备氟苯尼考固体分散体,制备方法简便易操作、质量可控,能提高药物的溶解度,其中PEG6000增溶效果最优,可广泛应用。 相似文献
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【目的】研究blaCMY-2阳性禽源奇异变形杆菌的多重耐药特征,并分析菌株CY32全基因组序列结构。【方法】对5株blaCMY-2阳性禽源奇异变形杆菌进行氟苯尼考和质粒介导氟喹诺酮类耐药基因检测、接合试验和blaCMY-2基因的Southern杂交定位,对其中一株菌CY32进行全基因测序和生物信息学分析。【结果】5株奇异变形杆菌携带的blaCMY-2位于染色体,其中,菌株CY12、CY32、S31和S52携带floR,菌株CY12和CY32携带qnrD。CY32的染色体同时含有SXT/R391型整合性接合元件(integrative and conjugative elements,ICEs)(ICEPmiJpn1)和PmGRI1共2种耐药基因岛。ICEs的可变区包含2个串联的复合型转座子(IS10构成),其中一个复合型转座子携带blaCMY-2;CY32的PmGRI1耐药岛含有12个耐药基因。与其他奇异变形杆菌携带的PmGRI1相比,多重耐药区差异最大的区域位于Tn21转座子... 相似文献
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《兽医药理学》是动物医学和动物药学专业的一门基础性课程，专业性极强。本文通过深挖兽医药理学这门专业课所蕴含的隐形思政元素，并将这些思政元素有机地融入到课程教学中，让兽医药理学这门课程既能传授专业知识又能进行思想政治教育，使兽医药理学教学与思想政治教育同向发力，从而达到立德树人的效果。 相似文献