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用PCR方法从人的基因组DNA中扩增了人血栓调节蛋白(hTM)基因,将其克隆到带有人EF-1α启动子的pEF-neo哺乳动物表达载体上,得到表达质粒pEF-TM。在转染pEF-TM的COS-1细胞中,hTM得到了瞬时表达,并且正确地定位到细胞膜上。用pEF-TM转染猪内皮细胞(PEC),经G418筛先得到稳定转染的克隆。凝血活性测定结果显示,表达hTM的PEC凝血时间明显延长,表明其抗凝血能力增强。通过显微注射方法,得到了1只F0代hTM转基因小鼠。Southern杂交结果表明,该转基因小鼠整合了9个拷贝的pEF-TM DNA,并能将外源DNA遗传给后代。 相似文献
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提高PCR产物T-A克隆效率的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
摘要:比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明,对于较短的PCR产物(500 bp左右),采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率;对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右),用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率;对于较长的PCR产物(6 000 bp左右),用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。 相似文献
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用冻干精子生产ICSI小鼠 总被引:1,自引:0,他引:1
前期研究中,我们采用小鼠卵母细胞胞浆内精子注射(ICSI)技术,成功地用新鲜精子获得了生理健康的ICSI小鼠。在此基础上,本文结合细胞冻干技术,进行了冻干精子ICSI生产试管小鼠的尝试。B6D2F1成年公鼠的精子在Tris-HCl-EDTA(pH8.2)溶液中冻干4 h后解冻,将其精子头注入到KM小鼠成熟卵母细胞的胞质中。6 h后,83.0%的卵子受精。用CZB溶液体外培养发现,冻干精子生产的胚胎,体外发育至2-C (92.0% vs 99.5%)、4-C(52.7% vs 97.2%)、桑椹胚(36.6% vs 86.3%)和囊胚的比例(21.4% vs 68.7%)极显著地(p<0.01)低于新鲜精子生产的ICSI胚胎。移植2-C期冻干精子ICSI胚胎检测体内发育,结果发现,D10的着床率为63.0%(17/27);胎鼠的出生比例为21.7%(13/60),这些ICSI小鼠成年后的生理和生殖能力正常。试验结果说明,精子冻干后,仍能生产ICSI动物,冻干技术可以用于哺乳动物精子的保存。 相似文献
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摘要:利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18(GenBank登录号:AF129872)的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框(open reading frame, ORF)长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21(DE3)中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。 相似文献
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利用人工辅助的显微操作技术,直接将精子注射至成熟卵母细胞质的方法,称为胞浆内精子注射技术,简称ICS I(in tracytop lasm ic sperm in jection)技术。目前,该项技术已经成功地用于生产试管婴儿、研究哺乳动物的受精机理、动物转基因、家畜性控胚胎生产等领域。本文详述了ICS I技术体系的发展背景、现状及其应用等方面。 相似文献
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抗精子sp18单克隆抗体对小鼠体外受精胚胎发育的抑制作用 总被引:1,自引:1,他引:0
哺乳类受精时,精子的多种膜蛋白、顶体蛋白和胞质蛋白参与了受精过程,因此,研究人员的目光都集中在这些功能蛋白在睾丸中的生成、附睾中的水解和扩散、顶体反应中的作用和扩散以及它们在受精过程中的主要功能等。然而,对于精子蛋白在受精后的命运这个基本问题的研究,几乎是个空白领域。可以肯定的是,精子的顶体区膜蛋白和顶体蛋白在受精过程中被释放;胞质蛋白和顶体内膜蛋白通过胞吞作用进入卵子内部,其中,胞质中的钙振荡蛋白可以激活卵子,是新生命的发动者;顶体后区和尾部膜蛋白伴随着受精过程掺入卵子质膜,演化成受精卵的质膜蛋白,对于这类蛋白的最终结局和潜在的功能,我们的认识还很有限,英国生物学家发现,大鼠精子尾部的2D6膜蛋白(23 kD)掺入受精卵质膜后,随着胚胎发育过程而逐渐弱化,至2-细胞期时,胚胎表面的2D6完全消失,因此无法研究该抗原在胚胎发育中是否具有生理功能,这方面的研究工作处于停滞状态。 相似文献
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本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%. 相似文献