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为建立一种鉴别诊断鸭瘟病毒的PCR方法,根据已发表的8株鸭瘟病毒株的长区开放阅读框(LORF11)等位基因序列,在其开放阅读框等位基因的上游5 bp和下游101 bp的位置设计1对特异性引物。应用这对引物对鸭瘟病毒LH2011株、v2085株、VAC株、Clone-03株DNA进行PCR扩增,分别获得了4 448 bp、3 277bp、934 bp和2 518 bp的特异性条带。此PCR方法特异性强,敏感性高,可检测到10TCID50或0.1LD50的鸭瘟病毒。在感染鸭瘟病毒的组织(肝脏)中均能检测到鸭瘟病毒DNA。对疑似鸭瘟的临床病料的检测结果也证明,建立的PCR方法不仅能够鉴别样品是否感染了鸭瘟病毒,而且能鉴别感染的鸭瘟病毒的来源。 相似文献
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为了构建鸭瘟鸡胚化弱毒株DEV(atten)的细菌人工染色体(BAC),将转移载体质粒pDEVgC-pHA2DNA和DEV(atten)DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行重组,通过三轮挑斑纯化,以获得纯化的鸭瘟重组病毒。将纯化的鸭瘟重组病毒的DNA电转化到E.Coli DH10B中,对获得的克隆用酶切、PCR方法进行鉴定并测序。提取阳性克隆的DNA转染CEF,以拯救重组病毒。再通过将带有相同同源臂和UL44(糖蛋白质C,gC)基因的片段和阳性克隆的DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组,以获得gC恢复病毒。采用0.01感染复数(MOI)感染CEF对亲本病毒、恢复病毒进行多步法生长曲线测定,比较其有无差异。结果显示:成功获得了DEV的mini-F重组病毒,命名为DEV(atten)-mini-F,获得2个阳性克隆S1、S2,将S1命名为pDEV(atten),应用pDEV(atten)拯救重组病毒获得gC恢复病毒DEV(atten)ΔgC-R,生长特性的结果显示亲本病毒与恢复病毒间无显著性差异。表明成功构建的DEV(atten)的细菌人工染色体为全基因组的感染性克隆。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。 相似文献
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为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为101拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。 相似文献
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高滴度的抗原是制备优质疫苗的首要条件。对6株伪狂犬病病毒在仓鼠肾(baby hamster kidney,简称BHK)细胞和猪睾丸细胞(swine testicular,简称ST)细胞上的增殖效率进行了比较,同时测定不同保存温度和冻融条件对病毒滴度的影响。结果表明,几株伪狂犬病病毒在BHK细胞和ST细胞上增殖效率均很高,可达到生产要求。相较于ST细胞,各毒株在BHK细胞上出现病变时间更早。然而,所有毒株在ST细胞上的病毒滴度都高于同期在BHK细胞上的滴度。强毒株AH02LA株在2种细胞上滴度可达10~(8.0) TCID_(50)/0.1 mL以上,表现为发生病变早,病毒增殖快,峰值到来早的特性。通过强毒株AH02LA株获得的基因缺失株LA-A株和自然传代缺失致弱株LA2017株峰值均达10~(8.0) TCID_(50)/0.1 mL,展现出优良疫苗株的潜质。保存条件试验表明,PRV在-70℃保存30 d和4℃保存12 d内滴度相对稳定,而-20℃保存的病毒滴度下降明显。多次冻融后,滴度有所下降,相较于-70℃,-20℃条件下冻融病毒滴度下降更为显著,建议避免多次冻融。本试验结果可为PRV疫苗抗原在实际生产中制备与保存提供科学依据。 相似文献
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猪细小病毒灭活疫苗NJ株毒种分离及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为防控猪细小病毒病,进行了猪细小病毒灭活疫苗毒种研究。将南京某猪场初产母猪流产胎儿的脾、肺等组织病料处理后接种ST细胞培养,获得了1株猪细小病毒强毒,将分离毒株适当稀释接种ST细胞,经3轮蚀斑纯化获得1株纯净的猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株),作为疫苗毒株。将NJ株接种ST细胞培养连续传15代,每代次病毒效价均不低于1 ml 107.25TCID50、血凝素效价不低于29。选择第5代病毒液,灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成灭活疫苗,以不同剂量分别免疫豚鼠和后备母猪,用血凝抑制试验(HI)和ELISA检测抗体效价。分别用剂量0.125 ml、0.250 ml和0.500 ml疫苗免疫豚鼠28 d后,各免疫组HI抗体效价均高于28,0.5 ml组HI抗体效价高达211,ELISA抗体均显示阳性(OD630≥0.32),分别用剂量0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml疫苗免疫后备母猪后,HI检测结果显示,3个剂量组免疫后1周HI抗体效价高于26,3周后达峰值,至免疫后4个月略有下降,2.00 ml剂量组HI效价最高(211.75)。ELISA检测结果显示,各剂量组在免疫后1周均转阳(OD630≥0.32),免疫后4～18周均维持较高水平。HI抗体效价和ELISA抗体水平与免疫剂量均呈正相关性。结果显示,利用NJ株病毒制备的灭活疫苗具有抗体产生快、效价高等特点,显示出良好的疫苗开发前景。 相似文献
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将猪源伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的强毒变异株AH02LA株在鸡胚成纤维细胞上进行连续传代,获得了不同代次的弱毒株,检测其安全性、免疫效力、生长特性及稳定性,并对其gE基因上、下游片段进行测序.对PRV AH02LA株的F151代进行3轮挑斑纯化,获得了1个毒株并将其命名为PRV LA2017株.用该毒株接种(剂量为106.00TCID50/头)试验猪,在接种后14 d内无任何临床症状;在免疫(106.00TCID50/头)后21 d攻毒(106.50TCID50/头),所有试验猪未出现任何猪伪狂犬病症状,体温正常,没有排毒.在攻毒前用ELISA检测,PRV gB抗体全部为阳性,PRV gE抗体全部为阴性;在攻毒后14 d这两种抗体均为阳性,体现出良好的安全性与保护性.对照组BarthaK61在攻毒后试验猪全部发病,体温高至40.5℃以上,且均检出排毒.测序结果显示LA2017株的gI部分基因与gE全部基因缺失.该毒株在CEF细胞及ST细胞上生长良好,在CEF上的滴度达到108.0TCID50/mL,在ST细胞上的滴度最高达109.5TCID50/mL,能满足活疫苗生产的要求.LA2017株安全性好,免疫效力强,生长滴度高,可以作为研制针对PRV变异株疫苗的候选毒株. 相似文献
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为获得安全、有效的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株弱毒疫苗，在前期研究的基础上，对PRV变异株TK、gE双基因缺失株(PRV LA1206株)进行传代致弱，在鸡胚成纤维细胞上连续传代75次，后经连续5代挑取单个病毒蚀斑克隆而得F80代，毒种命名为PRV LA1206-80株，并对其进行安全性及免疫效力评价。生长动力学试验结果显示，PRV LA1206-80株与PRV LA1206株生长动力学相似。仔猪安全性试验结果显示，滴鼻接种1日龄PRV抗体阴性仔猪后所有仔猪均未出现发热及临床症状，表明该毒株对1日龄仔猪安全。攻毒保护试验结果显示，28～35日龄仔猪肌肉注射接种PRV LA1206-80株或PRV LA1206株7 d后进行变异株PRV AH02LA株滴鼻攻毒，可产生良好保护，所有仔猪均未出现体温反应、临床症状和排毒。而PRV Bartha K61株免疫猪7 d后攻毒，均出现了体温反应，其中1头发病，且鼻拭子样品均检出病毒。综上所述，相较于PRV LA1206株，在鸡胚成纤维细胞上连续传代后获得的PRV LA1206-80株已... 相似文献
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