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[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。 相似文献
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慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。 相似文献
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鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究将鸡卵清蛋白5端调控区调控人促红细胞生成素的pOV-hEPO特异表达载体用脂质体包埋，和供体细胞融合后，显微注射入450枚受体胚盘，采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡，PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统，为制备表达人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。 相似文献
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随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考。 相似文献
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转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3’端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3’端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出“拷贝数依赖性”。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。 相似文献
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为检验甘蓝短散布元件（SINE）对植物转基因表达的影响,采用PCR方法,从甘蓝基因组中克隆了一段短散布元件序列（Short Interspersed Nuclear Element,SINE）,该SINE具有核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的结构特征,将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧翼,形成SINE调控的植物表达载体,采用农杆菌介导法,将含SINE序列和不含SINE序列的植物表达载体导入烟草中。对转基因植株进行GUS活性定量测定,结果表明,SINE表现出类似MAR的功能,可以提高外源uidA基因的表达水平,与不含SINE的转化植株相比,外源基因的平均表达水平提高了2倍,但转基因植株个体间表达水平存在较大的差异。 相似文献
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Xiaoming HU Jing GUO Chunling BAI Zhuying WEI Li GAO Tingmao HU Shorgan BOU Guangpeng LI 《农业科学与工程前沿(英文版)》2016,3(1):87
In the present study, follistatin (FST) gene expression vectors with either a bicistronic gene transfer cassette alone, or a bicistron gene cassette carrying a matrix attachment region (MAR) were constructed and transfected to bovine fetal fibroblasts. Evaluations of both the integration and expression of exogenous FST indicated that the pMAR-CAG-FST-IRES-AcGFP1-polyA-MAR (pMAR-FST) vector had higher capacity to form monoclonal transgenic cells than the vector without MAR, though transient transfection and integration efficiency were similar with either construct. Remarkably, protein expression in transgenic cells with the pMAR-FST vector was significantly higher than that from the bicistronic vector. Exogenous FST was expressed in all of the pMAR-FST transgenic mice at F0, F1 and F2. Total muscle growth in F0 mice was significantly greater than in wild-type mice, with larger muscles in fore and hind limbs of transgenic mice. pMAR-FST transgenic mice were also found with more evenly distributed muscle bundles and thinner spaces between sarcolemma, which suggests a correlation between transgene expression-associated muscle development and the trend of muscle growth. In conclusion, a pMAR-FST vector, which excluded the resistant genes and frame structure, enhances and stabilizes FST gene expressions in both transfected cells and transgenic mice. 相似文献
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Germline transmission of exogenous genes in the chicken 总被引：7，自引：0，他引：7
R A Bosselman R Y Hsu T Boggs S Hu J Bruszewski S Ou L Kozar F Martin C Green F Jacobsen 《Science (New York, N.Y.)》1989,243(4890):533-535
Difficulties associated with in vitro manipulation and culture of the early chicken embryo have restricted generation of transgenic chickens to approaches that use replication-competent retroviruses. The need to produce transgenic chickens in the absence of replicating virus prompted development of a new method of gene transfer into the chicken. Microinjection of the replication-defective reticuloendotheliosis virus (REV) vector ME111 beneath unincubated chicken embryo blastoderms results in infection of germline stem cells. This vector contains genetic information exogenous to the chicken genome, including both the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene and the Tn5 neomycin phosphotransferase gene. About 8 percent of male birds hatched from injected embryos contained vector DNA in their semen. All four positive males tested passed vector sequences onto their progeny. Analysis of G1 offspring showed that gonads of G0 male birds were mosaic with respect to insertion of vector provirus. Thus, primordial germ cells present in the unincubated chicken embryo blastoderm are susceptible to infection by defective REV vectors. 相似文献
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将pGFP-2质粒线性化,利用精子介导,通过人工授精技术导入意大利蜜蜂处女王,然后将授精王介绍到无王群繁殖后代。结果:试验群产生了一群绿色荧光阳性蜜蜂;对阳性蜂群后代分析发现,1~2日龄幼虫能检测到荧光,提取蜜蜂DNA进行PCR扩增得到预想的片断,通过RT-PC分析,从转录水平上证实转导的外源基因获得表达。结论:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,通过精子介导法能够生产克隆转基因蜜蜂。 相似文献
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[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础. 相似文献
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利用PCR方法从pSEAP2-control质粒中扩增获得人胎盘碱性磷酸酯酶基因plap的cDNA,将其克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)的卵清蛋白基因调控区下游。通过脂质体精子载体法人工授精母鸡,收集鸡蛋、孵化。雏鸡出壳后,抽提鸡冠基因组DNA,采用PCR方法检测两组孵化后代中的嵌合体鸡,第1组母鸡(95羽)中plap的PCR阳性检出率为75%,第2组母鸡(128羽)的阳性检出性率为81%。经Western blotting检测,仅1只嵌合体母鸡所产鸡蛋蛋清中检测到plap产物的存在。 相似文献
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转基因表达有机磷水解酶(OPH)提高黄瓜降解蝇毒磷能力的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为快速提高黄瓜降解有机磷农药残留的能力,选取能广泛降解有机磷农药的有机磷水解酶(OPH)为表达蛋白,构建CaMV 35S启动子驱动有机磷水解酶基因(opd)的植物表达载体pSOP,经双酶切证明重组载体含有插入位置和方向皆正确的目的片段。通过农杆菌介导遗传转化黄瓜子叶节,诱导和筛选出9株抗性苗,获得3株GUS染色和PCR阳性转化苗。酶活性分析表明,转基因黄瓜降解蝇毒磷能力是对照(非转基因株)的4.7~9.7倍,最高达到7.8μmol/(mg.min),有助于加快降解黄瓜中的有机磷农药残留,为食品安全研究提供借鉴。 相似文献
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表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果 总被引：12，自引：0，他引：12
【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。 相似文献
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分别将鸡Igλ轻链信号肽、小鼠纤溶酶原信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合,产生带有信号肽的中间载体pEGFP-SPc和pEGFP-SPm。对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-SPc-λ和pEGFP-SPm-λ。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测融合蛋白的分泌表达,结果显示,鸡Igλ轻链信号肽能引导鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子的分泌表达;而小鼠纤溶酶原信号肽不具备引导该重组蛋白分泌表达的功能。表明信号肽在蛋白分泌表达中的关键作用,重组蛋白的分泌表达要选择合适的信号肽。 相似文献
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表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究 总被引：5，自引：0，他引：5
从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY6 81,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY(NP +LacZ)。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S FPV 0 17的鸡胚成纤维细胞 ,在X gal存在的条件下 ,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR、Western blot鉴定 ,结果证明 ,获得了能高效表达AIVNP蛋白的重组禽痘病毒rFPV NP。SPF鸡体内的免疫保护试验结果表明 ,它能够诱导机体产生较高水平的NP特异性抗体 ,并对H5N1和H7N1这 2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。 相似文献
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根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物,以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段,克隆入pUCm—T载体后,经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302,分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中,为进一步研究其表达功能奠定了基础。 相似文献