S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达   总被引：3，自引：1，他引：2  

王莲哲  张现青  李洋  杨广笑  何光源 《农业科学与技术》2009,10(2):49-53

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸（Met）的活性形式。生物体内,SAM由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）[EC2．5．1．6]催化L．甲硫氨酸（L．Met）和A11）反应而合成。酿酒酵母细胞中有2种SAM合成酶的同工酶,即SAMS1和SAMS2,分别由基因saml和sam2编码,二者氨基酸序列的同源性高达92％。在过量L-Met存在下,saml的转录受到抑制;已有酶促法合成研究显示sam2编码的合成酶没有产物抑制现象。笔者将sam2基因连接于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,并通过同源重组整合到酵母染色体上,以实现SAM合成酶的分泌性表达,为开发和建立酶促法生产SAM工艺奠定基础。  相似文献   

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达     

黎卓键 《安徽农业科学》2011,39(31):19054-19056

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。  相似文献   

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)     

雷正玉  张晓 《农业科学与技术》2014,(5):854-857

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。  相似文献   

功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测     

张蕾  李鹏飞  李伟伟  马鸣潇 《安徽农业科学》2010,38(26):14455-14456

[目的]检测克隆猪α干扰素基因（IFN-α基因）在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素（PHA）诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。  相似文献   

草莓FaSAMS1蛋白的酵母外源表达及表达产物的酶学分析     

张天宇  沈元月 《北京农学院学报》2015,30(3):15-18

草莓果实中S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因FaSAMS1参与草莓果实的成熟调控,但其蛋白的生物化学特性目前还不清楚。为了探讨草莓果实中FaSAMS1蛋白性质,本研究首先通过RT-PCR克隆了FaSAMS1基因的编码区cDNA序列,并成功构建了酵母表达重组载体pPICZA,进而转化酵母表达菌株X-33,最后成功诱导并纯化了FaSAMS1融合蛋白。对融合FaSAMS1蛋白的酶活性分析表明,反应体系中FaSAMS1蛋白含量为0.09mg,FaSAMS1蛋白浓度为0.454mg/mL,酶活力为0.32U,比活力为3.56U/mg,本研究为乙烯参与草莓果实成熟调控提供了生物化学证据。  相似文献   

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化     

肖庆振  王日文  王洪霞  冀芦沙 《安徽农业科学》2011,39(32):19674-19676,19683

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。  相似文献   

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)     

冀芦沙  肖庆振  王曰文  王洪霞 《农业科学与技术》2012,(4):731-734

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。  相似文献   

穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及表达     

王庆宇  金凤燮  鱼红闪 《安徽农业科学》2011,39(10):5799-5802

[目的]克隆并表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因。[方法]将穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。[结果]重组酵母菌在0.5%甲醇中培养144 h后,所提取的酶蛋白具有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为58 kD。[结论]穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因得到了表达。  相似文献   

低温胁迫对甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶mRNA表达水平的影响   总被引：1，自引：0，他引：1  

岳昌武  肖静  凌锌  曾霓 《农业科学与技术》2008,9(1):11-14

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（s-adenosylmethionine synthetase SAMS）是植物代谢中的一个关键酶,它催化甲硫氨酸与ATP生物合成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM是生物合成乙烯以及多胺的前体,参与了植物的转甲基、转氨丙基、转硫反应等多种重要的生理过程。Frank等研究发现,SAM可以与RNA结合参与基因表达调控。近年来研究表明,乙烯和多胺都参与了植物抗逆反应,  相似文献   

黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

康伟  王智  詹冬玲  雷霆  冯雁 《吉林农业大学学报》2006,28(6):623-627

将黑曲S（Aspergillus riger）NRRL3135中的植酸酶基因转入毕赤酵母GS-115中，并整合到染色体DNA上，然后进行诱导表达。通过SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，发现重组毕赤酵母GS-115分泌了1个约100kD的蛋白，分泌的蛋白较大。用脱糖基化酶endoglycosidase H降解后，形成了约50kD的蛋白，与植酸酶基因产物的理论值相符。通过对表达产物的酶学性质研究，发现该表达产物在pH2．5和pH5．5时具有较高植酸酶活性，同时该表达产物的最适温度约为55℃。这说明植酸酶得到正确的分泌表达。  相似文献   

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达     

王生富  孙晓林  段凤云  何延华  闫鸿斌  景志忠 《甘肃农业大学学报》2010,45(5)

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.  相似文献   

重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化研究     

蒋倩倩  李慧玲  刘莉莉  高宁  程玉鹏 《安徽农业科学》2014,(19):6166+6169-6166,6169

[目的]研究重组敬钊毒素在毕赤酵母中的表达与纯化.[方法]通过设计、构建Jztx-Ⅲ/pPIC9k表达载体,经电转化、甲醇诱导后使敬钊毒素在毕赤酵母GS115中进行表达,并利用C-端6×His标签进行分离纯化.[结果]Jztx-Ⅲ可以在毕赤酵母GS115中高效表达,经亲和层析纯化后其产量可达到95 mg/L.[结论]该试验结果解决了敬钊毒素资源有限产量较低的问题.  相似文献   

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达     

裘梁  杨萍  游清徽  董得刚  乔贝贝  王曼莹 《安徽农业科学》2012,40(26):12769-12771

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。  相似文献   

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究   总被引：2，自引：1，他引：1  

高键  李杰 《东北农业大学学报》2009,40(8)

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。  相似文献   

Exendin-4基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达     

徐良  王文静  邱宇航  杨好冬  王小纯 《郑州牧业工程高等专科学校学报》2012,32(1):12-15

根据GenBank中已公布的编号为AAB2200的Exendin-4氨基酸片断,及酵母密码子偏好性,设计了Exendin-4在酵母中的表达序列。利用基因工程技术,将编码Exendin-4的蛋白基因亚克隆到含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达栽体pPIC9K-E4。用电转化法将线性化的pPIC9K-E4转化入毕赤酵母菌株GSll5,转化子经MD平板筛选,得到的阳性菌株再用浓度梯度递增的G418筛选多拷贝重组子。将MM和MD平板筛选得到Muts菌株用甲醇诱导表达6d,每隔24h取样。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示,诱导后第6天表达量达到最高。  相似文献   

来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达   总被引：6，自引：1，他引：6  

王亚茹  姚斌  罗会颖  袁铁铮  都占魁  史秀云  伍宁丰  范云六 《中国农业科学》2004,37(5):762-762

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I  相似文献