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本研究旨在克隆牛干扰素调节因子9（bovine interferon regulatory factor 9，BoIRF9）基因，分析其生物学信息，并表达其抗原优势区。从感染水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的EBK细胞中提取总RNA，以反转录得到的cDNA第一条链为模板，参考GenBank中牛IRF9基因序列设计特异性引物进行BoIRF9基因的扩增，对克隆得到的BoIRF9基因进行分子特征、高级结构与分子进化等生物学分析。根据BoIRF9的亲水性、抗原指数和表面可及性，设计1对特异性引物克隆BoIRF9的抗原优势区域片段，将其连接至pET30a（+）载体，构建重组表达质粒pET30a-IRF9-Part。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，经IPTG诱导表达抗原优势区域蛋白，运用SDS-PAGE和Western blotting方法进行蛋白质鉴定。结果显示，本研究克隆得到BoIRF9基因全长1 684 bp，CDS区长1 320 bp，编码439个氨基酸；BoIRF9氨基酸序列与人、马、猪、山羊相似性为80.0%~96.2%；进化树分析结果显示，荷斯坦奶牛与山羊亲缘关系最近，其次为猪、马、非洲象和人；BoIRF9蛋白的分子式为C2139H3342N594O658S18，分子质量为48.5 ku，理论等电点（pI）为5.71；BoIRF9基因编码蛋白不存在跨膜结构，无信号肽，存在1个潜在的N-糖基化位点和多个磷酸化位点；BoIRF9蛋白二级结构含有115个α-螺旋、22个β-转角、68个延伸链和234个无规则卷曲；BoIRF9蛋白包含2个保守结构域，选择包含第一个保守结构域的第12－221位氨基酸作为抗原优势区域，克隆出648 bp的基因片段，并表达出分子质量为27 ku的重组蛋白。本研究结果可为干扰素调节因子的深入研究提供参考。 相似文献
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试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。 相似文献
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本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素(IFN-γ)基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1-6位氨基酸为胞内区域,7-28位氨基酸为跨膜区域,29-167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(58.08%)和无规则卷曲(33.53%)为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。 相似文献
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通过克隆、表达海南原鸡程序性细胞死亡分子10(Programmed cell death10,PDCD10)基因,对其蛋白进行生物信息学分析。采用RT-PCR方法克隆得到海南原鸡PDCD10基因CDS区,将扩增产物与原核表达载体pET42a连接,构建pET42a-PDCD10重组质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析;运用生物信息学软件对所获得基因的核苷酸序列进行分析,并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。克隆获得了PDCD10639bp的CDS区核苷酸序列,融合蛋白分子量约为57ku,生物信息学分析发现,PDCD10CDS区包括1个639bp的开放读码框,编码212个氨基酸。该蛋白不含信号肽,无跨膜区,二级结构中存在大量α-螺旋。研究结果为进一步开展海南原鸡PDCD10的功能研究奠定了坚实的基础。 相似文献
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试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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利用生物信息学软件对减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127纤维蛋白进行抗原特性分析,人工合成融合基因Knobs,将其克隆到原核表达载体pET28a的多克隆位点,构建原核表达载体pET28a-Knobs,将其转化到感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS中,经30℃、1.0 mmol.L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示:目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为26.0 ku;Western blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。本试验为进一步研究EDSV抗原结构域的免疫原性以及减蛋综合征基因工程疫苗的开发奠定了基础。 相似文献
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绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV)NM株基因组全序列，设计了1对包含囊膜(env)基因在内的引物，并在5′端分别设计了HindⅢ和BnmHⅠ酶切位点，利用PCR技术扩增env基因，通过连接反应将其克隆于pET-30b表达载体上。序列分析表明，env基因全长1836bp，编码612个氨基酸残基；构建表达重组质粒env—pET—30b，转化大肠埃希氏菌BL21，经IPTG于37℃诱导培养，SDS—PAGE电泳分析表明，表达的env基因融合蛋白分子质量约为69ku。 相似文献
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试验旨在对单增李斯特菌临床分离株(LM90SB2)的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956bp,ORF全长为1 857bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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本试验对犬冠状病毒核衣壳蛋白编码的基因进行原核表达,并进行生物信息分析。结果显示,成功获得N基因,全长为1149 bp,编码382个氨基酸。SDS-PAGE显示,His-N重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为62 ku。W estern blot分析表明成功表达目的蛋白。生物信息分析发现CCo V BC-1株与CCo V A76株和CCo V HLJ-072株亲缘关系较近;CCo V N蛋白中含有3个结构域和9个潜在的优势抗原表位。 相似文献
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从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta，IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象，提取肝脏总RNA并反转录为cDNA，设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区，将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上，获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β，并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析；将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明，从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp，编码186个氨基酸；该蛋白为分泌性蛋白，前21个氨基酸为信号肽序列；二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%，与禽的同源性最低（35.2%）；从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%，但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%，存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示，带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别，条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。 相似文献
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本研究旨在探索作为先天免疫相关分子的BCL10蛋白对山羊的免疫调控。实验采用RT-PCR、3'RACE和5'RACE克隆方法,以NCBI中山羊BCL10预测基因序列为模板,克隆初生羔羊脾脏组织BCL10基因cDNA序列,并进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术检测羔羊BCL10基因各免疫相关组织转录表达谱;鉴定p EGFP-N1-BCL10重组质粒在细胞的真核表达效果。结果表明:克隆得到BCL10基因cDNA全长1 023 bp,其中CDS为693 bp,编码230个氨基酸;生物信息学分析结果发现山羊BCL10蛋白是一种N端存在CARD结构域、非分泌、非膜结合的胞内蛋白,氨基酸序列与水牛、绵羊的亲缘关系最为接近;颌下腺中BCL10基因表达量显著高于肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及血液(P0.05),胸腺中BCL10基因表达量显著高于血液(P0.05),血液表达最少;成功构建了BCL10基因完整CDS序列的p EGFP-N1-BCL10重组载体,并在HEK293T真核细胞正常表达。本研究首次克隆出羊BCL10基因cDNA全长序列,检测了基因表达分布情况,构建了重组载体,为进一步探索山羊BCL10基因功能及蛋白免疫机制提供理论基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(2)
本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网(44.4%)、线粒体(33.3%)、细胞质(11.1%)和细胞核(11.1%)中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋(29.10%)、延伸链(21.54%)、β-转角(9.84%)及无规则卷曲(39.52%)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。 相似文献
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本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。 相似文献
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山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白.应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体.重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白.结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmo|·L-1 IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku).结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件. 相似文献
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本试验旨在构建原核表达载体pET30a(+)-NCC,对斯氏副柔线虫NCC基因特性进行生物信息学分析。应用RT-PCR技术扩增斯氏副柔线虫NCC基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),利用生物信息学软件对序列结构与抗原表位进行分析。结果显示,NCC基因全长711bp,编码237个氨基酸,蛋白质理论大小值为25.252ku,理论等电点为6.33,蛋白质不稳定指数为40.08;跨膜结构和信号肽分析表明NCC蛋白存在1个跨膜区,无信号肽区域,其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上。NCC蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位,本试验为斯氏副柔线虫诊断方法的建立及免疫防控提供参考。 相似文献
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根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础. 相似文献
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采用PCR方法从鲁西黄牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498 个核苷酸,含1个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%.表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%.表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后免疫昆明系小鼠2次,制备高滴度的牛IFN-α抗血清.结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2,实现了高效表达和纯化,并制备了鼠抗牛IFN-α,为重组牛干扰素的开发奠定了基础. 相似文献