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实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的细胞中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的gE基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.经临床应用表明,该荧光定量PCR方法的建立为猪伪狂犬病病毒的早期诊断并定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础. 相似文献
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为研究伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染猪场伪狂犬病的净化,采用PCR和ELISA进行病毒核酸与抗体检测,采用不同的净化方法,选取云南省3个自繁自养种猪场,A场同时净化PRV和PCV2,免疫接种PRV疫苗;B场净化PRV,免疫接种PRV疫苗;C场同时净化PRV和PCV2,免疫接种PRV和PCV2疫苗。结果表明,C场实施猪伪狂犬病净化前gE阳性率为15.94%,gB阳性率为86.96%,实施猪伪狂犬病净化3年后gE阳性率为1.43%,gB阳性率100%。结果提示,C场在同时净化PRV和PCV2,同时接种猪伪狂犬病和圆环病毒2型疫苗的模式下,净化效果最优,为地区种猪场提供疾病净化思路。 相似文献
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猪伪狂犬病(PR)临床上以仔猪的神经症状、呼吸道系统疾病及种猪发生流产等繁殖性障碍为特征,猪伪狂犬病病毒(PRV)是引起PR的病原。猪呼吸道疾病综合征(PRDC)是由多种致病因素导致的一种猪复杂的呼吸道疾病,PRV也是引起PRDC的主要病毒性病原之一。近年来规模化猪场对PRV的免疫均选用了基因缺失苗,使用基因缺失苗能更好地利用针对特异性蛋白的Elisa检测方法,将缺失苗免疫动物与野毒感染动物或常规疫苗免疫动物区分开。2010年10月,我们对涪陵区19个使用过猪伪狂犬病gE缺失苗的规模化猪场进行了PRV病原抗体和疫苗抗体的监测。 相似文献
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从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。 相似文献
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应用PCR技术检测伪狂犬病病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(11):2101-2106
猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)均可引起母猪的繁殖障碍疾病。本试验以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX为载体,构建了表达PPV流行毒株VP2基因的重组PRV(rPRVSMX-VP2)。Western blot和IFA试验均证明了重组病毒在细胞中成功表达了VP2蛋白。动物试验结果证明重组病毒可以诱导猪体产生特异性的PPV抗体,首免后40 d血凝抑制抗体(HI)为1∶192±73.9,虽然低于PPV商品化灭活疫苗免疫后所产生的HI抗体,但此时免疫系统被认为是激活的水平;重组病毒诱导产生的PRV抗体与载体毒株rPRVSMX诱导产生的抗体相当。由此可见该重组毒株经过优化后,可以作为二联疫苗的候选毒株防控猪伪狂犬病和细小病毒病。 相似文献
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本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。 相似文献
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为了解某集约化猪场伪狂犬病病毒（PRV）的感染情况,清除感染猪只,净化伪狂犬病,提高猪群的健康水平.采用PRV gE抗体ELISA检测试剂盒,对该场免疫了猪伪狂犬病基因缺失疫苗的猪群进行3次野毒感染检测;应用荧光PCR方法,对临床发病的仔猪进行PRV病原检测.经过动态监测、加强综合防控和逐步淘汰措施,该猪场的PRV野毒感染率从35.29％逐步降低至0％,猪场自繁的仔猪存活率高,无PRV感染,净化效果良好. 相似文献
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从送检的2日龄病猪脑部分离到1株病毒。该病毒接种的Balb／c小鼠出现了典型的伪狂犬病症状,接种BHK-21细胞48h后出现了圆缩、集聚,脱落等典型的细胞病变,猪狂犬病毒阳性血清能特异性的中和该分离病毒。根据GenBank公布的PRV的gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,证实该病毒为伪狂犬病毒。 相似文献
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在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID50和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5）,ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。 相似文献
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为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013-2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示：样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。 相似文献
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试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。 相似文献
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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒GXBB株的分离鉴定及gE基因的克隆分析 总被引：4，自引：2，他引：2
从广西玉林博白某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价（TCID50）为10-7.22/0.1 ml。设计扩增PRV gE胞外区基因的引物,能扩增出约947 bp的特异性片段,将扩增出的目的片段进行克隆、测序,并与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.7%～99.4%之间,氨基酸同源性在98.1%～99.1%之间,上述结果证实该分离毒株为伪狂犬病病毒,命名为GXBB株。GXBB株与国内流行毒株同源性很高,说明目前广西PRV流行株变异不大。这为下一步广西伪狂犬病的预防和净化工作提供科学的理论基础。 相似文献