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1.
《中国预防兽医学报》2021,(8)
为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV缺失后对Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因转录水平的影响。结果显示,通过Red同源重组构建了clpV基因缺失株与回补株,利用分光光度计测OD600nm绘制野生株、缺失株和回补株的生长曲线。结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV生长速率无明显变化;其运动和BF形成能力的检测结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV的运动能力降低(p0.05),而其BF形成能力则升高(p0.05);分别将DE17、DE17ΔclpV和DE17ΔclpV感染DF-1细胞,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV对DF-1细胞的黏附能力升高(p0.01),而侵入能力减弱(p0.01)。荧光定量检测结果显示,与野生株相比,clpV缺失株csgD、icmF、lip和hcp基因的转录水平升高(p0.05),而vgrG和rpoD基因的转录水平降低(p0.05)。本研究结果表明,T6SS的分子伴侣ClpV影响APEC的生物学特性,为进一步研究T6SS的功能及其致病机制提供参考。 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2015,(8)
以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,并且利用Real-time PCR检测AE17、△RyhB和△RyhB-comp的8个毒力基因转录水平。结果成功构建出了基因缺失株△RyhB和回复株△RyhBcomp,△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。同时,Real-time PCR结果显示,△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平分别上调约1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使毒力基因的转录水平有所降低。根据以上结果,推测RyhB对APEC的毒力具有极其重要的调节作用。 相似文献
3.
运用大肠杆菌Red同源重组系统,对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE02株的ibeA基因进行了缺失,其结果为揭示IbeA的功能奠定了基础.通过对APEC ibeA基因缺失株与人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的黏附与侵袭,发现ibeA基因缺失后与HBMECs的黏附率为45%,侵袭率为1.2%,相对于野生型APEC均显著降低;提示ibeA基因是APEC的重要致病因子. 相似文献
4.
qseC和luxS是多杀性巴氏杆菌群体感应系统相关基因,为探讨其双缺失对多杀性巴氏杆菌致病性及交叉免疫保护的影响,本研究在前期构建的牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)qseC基因缺失株(ΔqseC)的基础上进行了luxS基因缺失,构建了qseC及luxS双基因缺失株(ΔqseCΔluxS)。与野生型PmCQ2相比,该双基因缺失株在生物膜产生方面显著上升,而其荚膜生成量、血清敏感性及其毒力却显著下调,与qseC单基因缺失相比,双基因缺失在调节菌株部分生物学特性方面具有正向或负向叠加效应。疫苗交叉免疫保护性方面,与ΔqseC及野生型PmCQ2比较发现,双基因缺失株中luxS基因的缺失,减弱了部分qseC基因缺失所赋予菌株的交叉免疫保护效果,但却增强了菌株对牛源F型多杀性巴氏杆菌的交叉免疫保护作用,相比PmCQ2的无交叉免疫保护作用,qseC及luxS双基因缺失仍赋予了菌株很好的交叉免疫保护性。研究结果表明,群体感应基因qseC和luxS均可调控多杀性巴氏杆菌毒力及其交叉免疫保护性,该双基因缺失株可作为多杀性巴氏杆菌广谱型疫苗候选菌株。 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2020,(4)
禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE205B基因组中存在前噬菌体phiv205-1。本文利用RED同源重组技术构建前噬菌体phiv205-1缺失株,采用倍比稀释的方法检测野生株DE205B和前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1在酸、盐和氧化应激等不利条件下的存活率,分析前噬菌体对APEC环境适应力的影响。结果显示,与野生株相比,前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1酸性耐受力下降了56.62%(P0.001),在氧化应激条件下的存活率下降了91.78%(P0.001)。为研究前噬菌体phiv205-1中影响宿主细菌对酸和氧化应激耐受的基因,采用real-time PCR检测了部分phiv205-1基因在氧化应激环境中的表达量,结果显示基因2971、2989、3327及Erf的表达量显著升高。进一步构建了Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf的单基因缺失株,环境耐受实验结果显示,与野生株相比,单基因缺失株Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf在H_2O_2环境下的存活率依次降低了89.32%、67.79%、27.84%和71.29%。研究表明,前噬菌体phiv205-1增加了细菌对环境压力的抵抗力,为宿主菌在恶劣条件下的生存提供了多种益处。 相似文献
6.
拟研究LuxS/AI-2群体感应系统对肠炎沙门菌(Salmonella enterica Serovar Enteritidis,SE)生物学特性的影响。利用Red同源重组系统构建LuxS/AI-2系统关键基因luxS缺失株,通过比较亲本株和luxS缺失株体外生长速率、药物敏感性、细胞黏附侵袭能力及生物被膜形成能力等生物学特性,初步分析AI-2/LuxS系统对SE生物学特性的影响。结果显示,luxS缺失株能够稳定遗传缺失的△luxS基因;体外生长速率略快;生物被膜形成能力明显增强;对DF-1细胞和Caco-2细胞黏附侵袭能力均显著增加;对氟喹诺酮类药物敏感性提高128~256倍,对氨苄西林、四环素、多西环素、氯霉素和氟苯尼考类等的药物敏感性提高了8倍。以上结果表明,LuxS系统影响肠炎沙门菌的生物学特性(如生物被膜形成、对细胞的黏附侵袭能力),并且该系统也通过某种耐药机制影响肠炎沙门菌的药物敏感性。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2016,(1)
phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P0.01)和62.17%(P0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。 相似文献
8.
CpxR是细菌中Cpx双组分系统（two component system,TCS）的反应调控蛋白,通过调控靶基因的转录表达,在细菌细胞膜稳定及毒力方面发挥作用。本研究旨在探究TCS CpxR对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）基本生物学特性、抗血清杀菌能力及致病性的影响。利用Red同源重组系统及互补质粒构建cpxR基因缺失株、互补株,然后比较分析野生株、基因缺失株与互补株的生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、药物敏感性、抗血清杀菌能力、动物致病性的差异。结果显示：cpxR基因缺失株与野生株、互补株的生长速度和运动性能无明显差异,且缺失cpxR基因不影响APEC的生物被膜形成能力。然而,缺失CpxR导致APEC对阿米卡星和卡那霉素耐药性降低。血清杀菌试验结果显示,CpxR有助于APEC的抗血清杀菌能力。动物感染试验结果显示,野生株、cpxR基因缺失株和互补株对雏鸭的半数致死量（LD50）分别为7.50×105、7.50×106、1.33×106 CFU,表明CpxR缺失显著降低APEC的毒力。综上表明,TCS CpxR在APEC耐药性、抗血清杀菌能力及毒力方面发挥作用,为阐明APEC的环境适应性、生存能力及致病机制提供参考。 相似文献
9.
为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响，试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株，通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响，并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示：APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异，但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株；TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(103.328)，显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05)；此外，TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01)，而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明：tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2020,(2)
大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力,鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一,本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA——RyhB对禽致病性大肠杆菌(APEC)运动性的影响,为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法构建AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,比较缺失株与原始株运动性特征,结合转录组学数据探究Fur和RyhB对APEC鞭毛以及生物被膜形成的影响。结果显示成功构建了AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,转录组学结果显示Fur的缺失基本上使所有鞭毛相关的基因下调。Fur的缺失使APEC的运动性显著减弱,RyhB对APEC的运动性没有显著影响,△Fur/RyhB较△Fur运动能力有所增加。△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力显著增强,△RyhB生物被膜形成减弱,与运动性趋势基本一致。Fur对禽致病性大肠杆菌的鞭毛组装有非常重要的作用,其负调控的RyhB一定程度上可以抑制这种作用机制的影响,并进一步影响了生物被膜的形成,为寻找相关药物靶点提供可能。 相似文献
11.
12.
The Escherichia coli type III secretion system 2 (ETT2) is found in most pathogenic E. coli strains. Although many ETT2 gene clusters carry multiple genetic mutations or deletions, ETT2 is known to be involved in bacterial virulence. To date, no studies have been conducted on the role of ETT2 in the virulence of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), which harbours ETT2. Thus, we deleted the ETT2 of APEC strain and evaluated the phenotypes and pathogenicities of the mutant. The results showed that deletion of ETT2 had no effect on APEC growth, but significantly promoted biofilm formation. In addition, as compared to the wild-type （WT） strain, the ETT2 deletion significantly promoted adherence to and invasion of DF-1 chicken fibroblasts and facilitated survival in the sera of specific-pathogen-free chickens. Analysis of the role of ETT2 in animal infection models demonstrated that the distribution of viable bacteria in the blood and organs of chicks infected with the ΔETT2 was significantly higher than those infected with WT. The results of RNA sequencing indicated that multiple genes involved in biofilm formation, lipopolysaccharide components, fimbrial genes and virulence effector proteins are regulated by ETT2. Collectively, these results implicated ETT2 is involved in the biofilm formation and pathogenicity of APEC. 相似文献
13.
Jing Tu Fengying Lu Shuang Miao Xintao Ni Pan Jiang Hui Yu Linlin Xing Shengqing Yu Chan Ding Qinghai Hu 《Veterinary microbiology》2014,168(2-4):395-402
Riemerella anatipestifer causes epizootic infectious disease in poultry and serious economic losses especially to the duck industry. However, little is known regarding the molecular basis of its pathogenesis. The ability to acquire iron under low-iron conditions is related to the virulence of a variety of bacterial pathogens. In this study, a sip (Riean_1281) deletion mutant CH3Δsip was constructed and characterized for iron-limited growth, biofilm formation, and pathogenicity to ducklings. Results showed that siderophore-interacting protein (SIP) was involved in iron utilization and the sip deletion significantly reduced biofilm formation and adherence to and invasion of Vero cells. In addition, the sip gene was absent in 1 of 24 (4.17%) virulent strains and 2 of 3 (66.7%) avirulent strains of R. anatipestifer, and the sip gene from six R. anatipestifer strains, which belong to serotypes 1, 2, and 10, respectively, shared 100% amino acid identities to those of R. anatipestifer strains DSM15868 and RA-GD. These results suggested that siderophore-mediated iron acquisition may be an important iron-uptake pathway in R. anatipestifer. Animal experiments indicated that the median lethal dose of the CH3Δsip mutant in ducklings was about 35-fold higher than that of the wild-type CH3 strain. Thus, our results demonstrated that R. anatipestifer SIP was involved in iron acquisition and necessary for its optimal virulence. 相似文献
14.
大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli type III secretion system 2，ETT2）参与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）的致病作用。本研究旨在探究ETT2结构基因epaPQR对禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病作用的影响，为进一步阐明ETT2的致病机制提供依据。基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建epaPQR基因缺失株和回复株，通过生长曲线测定、运动性和生物被膜形成能力等试验，分析epaPQR基因对APEC生物学特性的影响；通过血清杀菌与组织载菌量等试验分析epaPQR基因对APEC致病性的影响。结果表明，成功构建ETT2结构基因epaPQR基因缺失株和回复株，epaPQR基因缺失后，其生长能力和生物被膜形成能力并没有显著改变（P>0.05）；但epaPQR基因缺失后，其运动能力显著降低（P<0.05），在透射电镜下观察到缺失株鞭毛数量明显减少，通过荧光定量PCR发现，鞭毛T3SS结构基因及鞭毛输出蛋白基因的转录水平均显著下调（P<0.05）。epaPQR基因缺失后其抗血清杀菌能力显著增强（P<0.05），缺失株AE81ΔepaPQR在雏鸡体内不同器官的定殖能力显著降低。结果说明，ETT2结构基因epaPQR参与调控APEC的鞭毛形成，影响APEC抗血清杀菌能力以及在体内组织器官的定殖能力，表明epaPQR在APEC致病过程中发挥重要作用，本研究为深入探究ETT2功能和APEC致病机制提供参考。 相似文献
15.
Duan Q Zhou M Zhu X Bao W Wu S Ruan X Zhang W Yang Y Zhu J Zhu G 《Veterinary microbiology》2012,160(1-2):132-140
Bacterial flagella contribute to pathogen virulence; however, the role of flagella in the pathogenesis of F18ab E. coli-mediated swine edema disease (ED) is not currently known. We therefore evaluated the role of flagella in F18ab E. coli adhesion, invasion, biofilm formation, and IL-8 production using an in vitro cell infection model approach with gene-deletion mutant and complemented bacterial strains. We demonstrated that the flagellin-deficient fliC mutant had a marked decrease in the ability to adhere to and invade porcine epithelial IPEC-J2 cells. Surprisingly, there was no difference in adhesion between the F18 fimbriae-deficient ΔfedA mutant and its parent strain. In addition, both the ΔfedA and double ΔfliCΔfedA mutants exhibited an increased ability to invade IPEC-J2 cells compared to the wild-type strain, although this may be due to increased expression of other adhesins following the loss of F18ab fimbriae and flagella. Compared to the wild-type strain, the ΔfliC mutant showed significantly reduced ability to form biofilm, whereas the ΔfedA mutant increased biofilm formation. Although ΔfliC, ΔfedA, and ΔfliCΔfedA mutants had a reduced ability to stimulate IL-8 production from infected Caco-2 cells, the ΔfliC mutant impaired this ability to a greater extent than the ΔfedA mutant. The results from this study clearly demonstrate that flagella are required for efficient F18ab E. coli adhesion, invasion, biofilm formation, and IL-8 production in vitro. 相似文献
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旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。 相似文献
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试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术，将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除，经连续传代检测缺失株遗传稳定性，并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示，试验成功构建缺失株，连续传30代未发现目的基因回复突变；在相同培养条件下，缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期，但缺失株生长速率低于亲本株；缺失株较野生株生化特性未发生改变；缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）；1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株，观察14 d，野生株组鸡全部死亡，而缺失株组无死亡。综上所述，本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株，缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变，但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。 相似文献
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The ibeB gene in neonatal meningitis Escherichia coli (NMEC) contribute to the penetration of human brain microvascular endothelial cells (HBMECs). However, whether IbeB plays a role in avian pathogenic E. coli (APEC) infection remains unclear. Thus, this study was conducted to investigate the distribution of the ibeB gene in Chinese APEC strains and examine whether IbeB is involved in APEC pathogenicity. The ibeB gene was found in all 100 detected E. coli isolates with over 97% sequence homology. These results indicated that ibeB is a conserved E. coli gene irrelevant of pathotypes. To determine the role of ibeB in APEC pathogenicity, an ibeB mutant of strain DE205B was constructed and characterized. The inactivation of ibeB resulted in reduced invasion capacity towards DF-1 cells and defective virulence in animal models as compared to the wild-type strain. Animal infection experiments revealed that loss of ibeB decreased APEC colonization and invasion capacity in brains and lungs. These virulence-related phenotypes were partially recoverable by genetic complementation. Reduced expression levels of invasion- and adhesion-associated genes in ibeB mutant could be major reasons as evidenced by reduced ibeA and ompA expression. These results indicate that IbeB is involved in APEC invasion and pathogenicity. 相似文献
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为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001（登录号：NC_018646）目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD50为5.68×104 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。 相似文献