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1.
【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。 相似文献
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奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白. 相似文献
3.
病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础. 相似文献
4.
《福建农业学报》2021,(5)
【目的】制备针对水稻叶绿体蛋白Chaperonin-60-beta(CPN60-β)多克隆抗体,为进一步研究CPN60-β蛋白在由NSvc4蛋白所介导的水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)的运动和致病过程中的调控功能及作用机制提供技术支持和材料准备。【方法】通过RT-PCR从水稻幼嫩叶片基因组扩增CPN60-β基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a(+)构建重组质粒pET-CPN60-β,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞进行诱导表达;将表达纯化的CPN60-β融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价高浓度的多克隆抗体。【结果】RT-PCR扩增获得的水稻叶绿体CPN60-β基因片段约为657 bp,构建的重组质粒pET-CPN60-β转化大肠杆菌BL21后在诱导剂IPTG浓度0.5 mmol·L~(-1)、摇床温度37℃、转速220 r·min~(-1)振荡培养3.5 h条件下成功表达CPN60-β融合蛋白。ELISA和SDS-PAGE检测表明,以纯化CPN60-β融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1∶1 000 000,抗体质量浓度约300μg·mL~(-1)。【结论】明确CPN60-β基因原核表达条件;制备获得的水稻叶绿体CPN60-β蛋白的多克隆抗体质量浓度和效价较高,可用于后续研究CPN60-β蛋白在RSV病毒运动和致病过程中发挥的功能。 相似文献
5.
根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。 相似文献
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为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。 相似文献
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[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因（ITGB6）胞外区,然后将其重组到pET-32a（＋）质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导及蛋白纯化。[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶2 560。[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因。 相似文献
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水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
俞乐 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(4):381-384
应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带. 相似文献
9.
《山东农业科学》2017,(12)
以感染番木瓜环斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelon strain,PRSV-W)的西葫芦叶片为供试材料,通过RT-PCR克隆PRSV-W衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV上得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP。将其转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后可表达分子量约为37 kD的融合蛋白。将融合蛋白从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰长耳兔,制备PRSV-W CP的抗血清。间接ELISA测定该血清效价为1∶8192。Western blot检测结果表明,该抗血清只与感染PRSV的西葫芦样品有特异性反应,而与健康西葫芦、感染西瓜花叶病毒的西葫芦及感染马铃薯Y病毒的普通烟样品均无反应。本研究为PRSV的快速检测以及CP蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
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应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。 相似文献
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采用原核表达的方法得到日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)组织蛋白酶B基因的重组蛋白。以日本囊对虾卵巢组织为试验材料,采用双标签(GST和His)的方法,用带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点以及6×His-tag的特异引物扩增Cathepsin B的开放阅读框,并连接至表达质粒pGEX-4T-2中。将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21中,在30℃条件下,用终浓度为1mmol/L的IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导5h得到最佳诱导量,His亲和柱进行纯化,纯化蛋白依次于8、6、4、2、1、0 mol/L尿素缓冲液中梯度透析,得到复性后可溶于水的重组蛋白,经SDS-PAGE检测,得到单一条带,其分子质量约为63ku。取冻干后的蛋白制备多克隆抗体,抗体效价达50 000,经Western blot检测,同样可在63ku处得到该条带,表明制备的组织蛋白酶B(CB)多克隆抗体具有特异性,该抗体可特异识别CB蛋白。 相似文献
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采用RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒(PPRV)中扩增出C基因。将C基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建出重组表达质粒pGEX-6P-1-PPRV-C。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞后,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定正确后,免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果表明:C蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为42ku;Western-blot结果表明重组C蛋白具有良好的反应原性;琼脂扩散试验结果表明制备的抗C蛋白多抗血清效价为1∶2。这一研究成功克隆出C基因,制备出多克隆抗体血清,为今后进一步深入研究C蛋白的功能提供了生物材料。 相似文献
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利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。 相似文献
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鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)引起的鲫造血器官坏死病是近年来对鲫(Carassius carassius)养殖业危害最大的疾病之一。通过PCR扩增得到ORF144基因全长,将其与pET-32a原核表达载体连接构建重组载体pET-ORF144,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到大小约 46 kDa的重组蛋白,该蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。将重组融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接ELISA检测显示抗体效价大于1∶51 200。经Western Blot验证该抗体可特异性识别感染CyHV-2的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白。间接免疫荧光结果显示该蛋白定位于细胞质,呈点状分布。结果表明构建的ORF144多克隆抗体可为病毒的基因功能和致病机制研究提供基础。 相似文献
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(h/b)的克隆、表达及溶血活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性.[方法]PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应.[结果]测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103Hu·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应.[结论]成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础.此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法. 相似文献
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禽流感病毒（AIV）非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在，因此，可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群．将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达，融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原．采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的ns1基因（654bp）；将该片段克隆至pSOC质粒soc基因3’端，成功构建了重组质粒pSOC-NS1，用该重组质粒转化EcoliB121（DE3）感受态细胞，以终浓度1mmol／mL的IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果表明pSOC-NS1融合蛋白相对分子质量约39000．Western-blot证实，表达产物与AIV H9N2病毒感染的小鼠血清具有良好的反应性． 相似文献
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【目的】体外真核表达梅花鹿（Cervus nippon）激活素 A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素 A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (Activin βA, ACTBA)亚基基因的cDNA 全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI 数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4 软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot 技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp 的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot 结果显示激活素 A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素 A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素 A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素 A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterol side-chain cleavage enzyme, CYP11A1 or P450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素 A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素 A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素 A重组蛋白,为下一步激活素 A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。 相似文献
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以小鼠脾脏cDNA为模板，用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒，在37℃诱导表达，重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子，制备特异性多克隆抗体；测定多克隆抗体的效价达到1∶4 096 000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体，为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。 相似文献