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1.
从临床病鸭中分离并鉴定了1型鸭疫里默氏杆菌,并在提取鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA后,用Sau3A I酶切,回收大小为0．07～4 kb的片段;将酶切片段与酶切的质粒载体pRSET连接后,电转化大肠杆菌Rosetta,成功构建了1型鸭疫里默氏杆菌的基因组文库,经检测库容量约为40000个。随机筛选30个单菌落,用pRSET通用引物进行PCR鉴定,统计结果显示插入片段的大小93．3％在1～3 kb范围内,成功构建了鸭疫里默氏杆菌基因组文库,为鸭疫里默氏杆菌功能基因的克隆及鉴定奠定了基础。 相似文献
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血清1、2、4、5型鸭疫里默氏杆菌的RAPD 总被引：2，自引：0，他引：2
以37℃摇震培养舜口烛缸厌氧培养，从12种培养基中选择出鸭疫里默氏杆茼的最优培养基和培养条件。以血清1、2、4、5型的鸭疫里默氏杆菌代表株A1、A2、A3、A4为研究对象，培养增殖后分别提取基因组DNA，利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，对其基因组进行了DNA分析。从20条随机引物中筛选出8条随机引物，这8条引物对4种血清型的鸭疫里默氏杆菌的扩增图谱有较好的多态性，可作为分子标记鉴别4种不同血清型的鸭疫里默氏杆菌，同时还筛选出能在4个血清型的鸭疫里默氏杆菌代表株均出现相同的特征条带，而对照茼大肠杆菌、沙门氏茼无该条带的随机引物，从而为鸭疫里默氏杆菌病的分子诊断打下了一定基础。 相似文献
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本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。 相似文献
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【目的】了解鸭疫里默氏杆菌的耐药性、基因组结构与遗传变异程度,为鸭疫里默氏杆菌耐药性与基因组研究提供参考。【方法】本研究对1株从病死鸭脑组织分离的鸭疫里默氏杆菌疑似菌株进行了PCR鉴定、耐药性检测及全基因组框架图测序,并基于16S rDNA与管家基因对其进行了遗传进化分析。【结果】测序数据经过质控与过滤后成功组装为1个包含38个contigs的基因组框架,使用Abricate软件、CARD在线数据库共检测出6种不同的耐药基因,其中4种与耐药表型符合;将基因序列提交至MLST数据库,发现了一种新ST型,定为ST93。构建的16S rDNA和管家基因进化树结果表明,分离菌株与2株鸭疫里默氏杆菌具有较近的亲缘关系。【结论】分离鉴定得到1株鸭疫里默氏杆菌,该菌株为多药耐药菌株,其基因组中携带多个耐药基因;鸭疫里默氏杆菌的基因变异程度较大,且存在跨区域流行传播风险。在临床用药时应注意合理用药,及时监控抗性基因的水平转移,防止鸭疫里默氏杆菌跨区域流行。 相似文献
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为建立一种更加准确、敏感的鸭疫里默氏杆菌检测方法,根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因序列设计2对巢式PCR引物,在完成最佳反应条件筛选、特异性、敏感性、重复性试验的基础上,建立巢式PCR检测方法.结果表明,建立的巢式PCR对1、2、10、X型鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA都能扩增出特异性片段,而对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门菌、鸭源金黄色葡萄球菌的基因组不能扩增出特异性片段,DNA最小检测量为0.392 fg/μL,是常规PCR的1 000倍.该巢式PCR方法具有快速、敏感、特异、通用的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定. 相似文献
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应用超声波裂解法制备的血清2型鸭疫里默氏杆菌裂解物作为抗原包被酶标板.以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功地建立了检测鸭血清2型鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELlSA方法.特异性试验和重复性试验证明此方法的特异性高、重复性好. 相似文献
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间接ELISA检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体方法的建立 总被引：2，自引：2，他引：0
应用1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)超声粉碎物作为包被抗原,建立检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的间接ELISA方法。用倍比稀释法确定HRP标记羊抗鸭二抗最佳稀释倍数为1∶3500,并用棋盘测定法确定抗原的最佳包被浓度为2.7mg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶300,阴性血清临界值为0.381;阻断试验结果表明,1型鸭疫里默氏杆菌与其抗血清阻断阳性,与鸭大肠杆菌O78、O132菌株和FJ4型鸭疫里默氏杆菌阻断阴性(无交叉反应)。重复性试验结果表明,该ELISA方法批内变异系数≤0.246,批间变易系数≤0.889。结果表明,该ELISA方法特异性强,重复性好,可用于1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)血清抗体的检测。 相似文献
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为研究鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)血凝素蛋白的功能,本实验克隆表达了鸭疫里默氏杆菌血凝素基因,并对其蛋白定位进行了分析。根据鸭疫里默氏杆菌CH3株血凝素基因序列设计一对特异性引物,采用PCR扩增不同血清型鸭疫里默氏杆菌的血凝素基因,进行序列测定与分析。结果表明其血凝素基因全长1 059 bp,编码352个氨基酸。不同血清型鸭疫里默氏杆菌血凝素间的氨基酸同源性为94.1%～100%,与黄杆菌3519-10株血凝素的氨基酸同源性为68.0%～68.9%。采用表达的血凝素蛋白免疫鼠血清和鸭抗鸭疫里默氏杆菌阳性血清对血凝素在细菌中的定位分析表明,鸭疫里默氏杆菌血凝素可能不是一种膜蛋白,而是存在于胞浆中的一种蛋白。 相似文献
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鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建及免疫原性基因初步筛选 总被引：2，自引：2，他引：2
以血清1型鸭疫里默氏杆菌(RA)CH-1株为材料提取基因组DNA,采用限制性内切酶Sau3A进行部分酶切消化,纯化回收1.0~6.5 kb片段,用T4DNA连接酶将回收片段与经BamH酶切并去磷酸化的ZAP Express载体进行连接,用噬菌体包装蛋白包装。经测定包装滴度为5.23×106pfu/mL,蓝白斑筛选重组率为96.8%,表明已成功构建血清1型RA CH-1株部分基因组文库。在此基础上以RA抗血清为抗体探针进行免疫筛选,获得3个阳性克隆,经多次重复筛选后再体内删除,得到含有插入片段的质粒并测序。生物信息学分析结果显示,该序列(GenBank登录号:DQ151838)含有1个编码369个氨基酸的完整开放阅读框架,是尚未见报道的RA基因序列,并且存在多个预测的抗原表位。 相似文献
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In an attempt to construct a genetic map of the fowl adenovirus (FAV) and to determine which viral proteins are natural immunogens in chickens and hence may be relevant to protective immunity we have constructed an expression library of FAV type 10 DNA. The genomic DNA was partially digested with the restriction endonuclease Sau3A, and this DNA was inserted into the 3' terminal end of the beta-galactosidase gene in a plasmid vector. To date, approximately 600 clones have been identified that express FAV type 10 antigens as determined by immunological screening with rabbit antisera to purified virus, including one that has amino acid homology with the 100 kDa protein of human adenovirus type 5. These antigen positive clones were found to contain DNA from FAV type 10 genome as determined by hybridisation to FAV DNA. These clones will allow the further characterisation of FAV and possibly the identification of potential vaccine molecules. 相似文献
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应用PCR技术从刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2（rh—potryprotein2）的部分基因，构建pGEX—KG—ROP2重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转入E．coli BL21CodonPlus中，在IPTG诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE和Western—blot分析鉴定。结果表明，扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9％，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000，可被兔抗弓形虫免疫血清识别。 相似文献
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Beltrán PK Gutiérrez-Ortega A Puebla-Pérez AM Gutiérrez-Pabello JA Flores-Valdez MA Hernández-Gutiérrez R Martínez-Velázquez M Alvarez AH 《Veterinary journal (London, England : 1997)》2011,190(1):181-183
This study combines two methodologies - vector expression of a genomic library and proteomics - to identify immunogenic proteins of Mycobacterium bovis. Immunization of BALB/c mice with a plasmid DNA pool from the library, containing approximately 8000 clones, induced a humoral response that facilitated the detection of 12 antigenic proteins by Western blotting. Two-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and mass spectrometry identified four proteins (Cpn60-1, HSP70, EF-Tu, and AdoHcyase). Such genomic immunization offers the possibility of in vivo screening of potential candidate M. bovis antigens. 相似文献
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根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性. 相似文献
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为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。 相似文献
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根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用. 相似文献
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新城疫病毒F48E8株cDNA文库的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以新城疫病毒（ＮＤＶ）中国标准强毒株为材料，分别用基因组ＲＮＡ及ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ。将ｃＤＮＡ通过同聚物加尾ｐｏｌｙ（ｄＣ）后克隆于末端加有ｐｏｌｙ（ｄＧ）的线性化质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）上，转化大肠杆菌ＴＧ１，经ＩＰＴＧ和Ｘ－ｇａｌ筛选及电泳检查，其中有５６个克隆含有大小在０．２～２．７ｋｂ范围的外源片段。斑点杂交鉴定有５２个是ＮＤＶｃＤＮＡ克隆，平均长度为１．３１ｋｂ，从而构建了ＮＤＶｃＤＮＡ文库。文库的统计学质量检验表明，拥有５２个克隆的Ｆ４８Ｅ８株ｃＤＮＡ文库可能覆盖ＮＤＶ整个基因组 相似文献