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采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461 nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变；然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定；最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达.测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异；定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体；Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应.结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的“靶向性”核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础. 相似文献
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采用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒pBABE—hygro hTERT，获取端粒酶催化亚基（hTERT）。将其定向克隆至载体pEGFP-N1，构建重组的荧光真核表达载体pEGFP-N1-hTERT。经双酶切、测序及转染成纤维细胞鉴定均证实hTERT、基因忆拷入pEGFP—N1载体中，成功构建了荧光真核表达载体pEGFP—N1—hTERT。构建的pEGFP-N1-hTERT，为进一步筛选目的细胞和建立永生化细胞系奠定了基础. 相似文献
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本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。 相似文献
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为获得增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEFP-N1-MSC,并观察其在猪成纤维细胞中的表达情况,用Nhe Ⅰ和Age Ⅰ消除pEGFP-N1质粒上的多克隆位点(MSC),然后补平连接,获得增强型绿色荧光蛋白编码基因的真核表达载体pEGFP-N1-MSC质粒,将pEGFP-N1-MSC质粒转化DH5α感受态细胞,于Kanr LB平板上筛选阳性克隆.重组子经Nhe Ⅰ和Age Ⅰ双酶切鉴定,将该载体转染猪成纤维细胞,24 h后观察EGFP表达情况,48 h后添加G418进行筛选.结果表明:改造的pEGFP-N1-MSC真核表达载体,成功转染猪成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光,获得可产生绿色荧光的pEGFP-N1-MSC载体,为构建猪双正选择同源重组载体奠定了基础. 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(4)
以pEGFP-N1和pAdTrack-CMV质粒为模板,通过PCR扩增分别获得GFP基因序列和Kan基因序列;以胶回收的目的序列为模板,通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan基因序列。回收GFP-Kan基因序列,插入至pCI-neo载体上,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan。再将设计合成的linker基因序列通过酶切、连接克隆至pCI-GFP/Kan载体上,涂布Kan抗性平板进行阳性克隆筛选,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-infect,即为新城疫病毒全长cDNA双启动子克隆载体。酶切和测序鉴定结果显示,pCI-infect载体构建成功。 相似文献
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经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。 相似文献
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旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。 相似文献
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伪狂犬病病毒Fa株gp63（gⅠ）基因转移载体质粒的构建 总被引：6，自引：2，他引：4
用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ（gE）和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7－1DNA后。回收大小约6.0kb片段，经T4DNA连接酶接后转化入大肠杆菌DH5α株，得到含gp63片段的转移载体质粒PP63，再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β－半乳糖苷酶（LacZ）基因作为报告基因，将其手稿P63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点，在选择培养基中筛选出表达β－半乳糖苷酶的转化子，构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒，命名为PP63LacZ。在该转移载体质粒中，LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连，经酶切、核酸分子杂交技术鉴定，结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。 相似文献
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YAN Tao WANG Rui-yao ZHU He-ping SU Xiao-tian WANG Ya-juan LI Hao-tian ZHOU Huan-min 《中国畜牧兽医》2015,42(6):1348-1354
The objective of this study was to solve the problem of construction a transgenic safety and site-specific integrated and marker-free LacS gene expression vector.Therefore,this experiment using plasmid pEGFP-N1 as the original framework,using PCR and restriction sites to add two with LoxP sequence at both ends of the marker genes in the pEGFP-N1 plasmid,attB sequence was added at the upstream of the multiple cloning sites for site-specific integration,then add the gene BC promoter-LacS-PolyA into the multiple cloning site.By restricted endonucleases digestion,these 3 fragments,Loxp,attB and LacS,were detected in the vector pEGFP-N1-LacS,PCR products and fragment size consistent with the expected results,the results of sequencing and oligonucleotide sequences also corresponding favorable,proved that each gene fragment was correctly connected to the corresponding position of the plasmid.In conclusion,the site-specific integrated and marker-free LacS gene vector was constructed successfully. 相似文献
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为构建鸡维甲酸相关孤核受体α（retinoid acid receptor related orphan receptor α,RORα）的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列（登录号：NM_001289887.1）设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48 h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600 bp的特异性片段,用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ可切出大小约4 700和1 600 bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48 h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加（P<0.05）。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。 相似文献
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试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
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XU Wan-yun WANG Hui-min WANG Wen-lun HU Meng-wei YAN Guo LI Jian-hua GAO Jian-feng 《中国畜牧兽医》2016,43(3):568-576
The specific primers were designed according to Ovis aries DRA gene sequence deposited in GenBank and the multiple cloning site of the plasmid pYD1,which was a vector used for protein surface display on Saccharomyces cerevisiae.The gene encoding DRA was amplified by PCR using the genomic RNA of Ovis aries.The 762 bp fragment was cloned and released in GenBank and registration number was KR422362.The PCR product was inserted into the yeast surface display plasmid vector pYD1 by double enzyme digestion.It was indicated that DRA gene was successfully integrated into the genome.Dot mutation was made at both ends of exon 2 in DRA gene for making restriction enzyme cutting site and design the exon 2 specific primers according to mutated Ovis aries DRA gene sequence.Sequenced exon 2 amplification products based on DNA pooling of sheep large sample template was analyzed the polymorphic loci.The polymorphic exon 2 246 bp fragment was obtained by double enzyme digestion and connected to surface display restructuring mutation carriers pYD1-DRA by the same double enzyme digestion,and then we successfully constructed yeast surface display libraries.We transformed it into Saccharomyces cerevisiae EBY100 cell.Yeast monoclone was identified by PCR amplification and sequencing,and we confirmed that DRA gene had been integrated into Saccharomyces cerevisiae genome.After galactose induced,it was detected that DRA gene library had been successfully demonstrated on the yeast cell surface under the fluorescence microscope by immunofluorescence method. 相似文献
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根据绵羊DRA基因序列和酿酒酵母表面展示载体pYD1上的多克隆位点设计特异性引物,从绵羊组织中提取总RNA并逆转录,利用PCR技术扩增得到DRA基因,克隆获得762 bp目的片段,并提交GenBank,登录号:KR422362。将该基因通过双酶切连接到表面展示载体pYD1 上,成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒pYD1-DRA。将DRA基因外显子2两端进行基因点突变,形成新的酶切位点,继而对外显子2设计特异性引物,对绵羊大样本进行DNA池化,并将外显子2扩增产物测序,分析其多态性获得多态位点。重组质粒双酶切得到246 bp具有多态性的外显子2,将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRA-TB上,成功构建了酿酒酵母表面展示库。将其转化用于表面展示的酿酒酵母EBY100感受态细胞中,得到酵母转化子,挑取酵母菌的单克隆通过PCR 扩增及序列测定证实了DRA基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中。经半乳糖诱导后,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到DRA基因库已成功展示在酵母细胞表面。 相似文献
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This study aimed to construct Oct4-EGFP pluripotent reporter vector in pig without destroying cells researching the expression pattern of Oct4, thus contributing to early embryonic development and stem cell research.Construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector with the In-Fusion PCR cloning technology, the Oct4 promoter sequence to direct the recombinant vector pEGFP-N1 instead of EGFP original CMV promoter plasmid pEGFP-N1 by Oct4 and liposomal transfection technology, and transfected into livability of porcine fetal fibroblasts cells.The results showed that it had successfully constructed Oct4-EGFP pluripotency reporter vector by PCR and sequencing verified, and initially verified the validity of the carrier in the parthenogenetic blastocysts.After liposomal transfection, 8 genetically modified cells of incorporates pluripotent report carrier with the Oct4-EGFP had been gained by screening and PCR.Thus, the In-Fusion PCR cloning technology could efficiently construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector and obtained transgenic positive cells could lay the foundation for the early development and embryonic stem cell research of pig embryos. 相似文献
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本研究旨在构建一套猪Oct4-EGFP多能性报告载体,可在不破坏细胞的前提下研究Oct4的表达规律,从而有利于早期胚胎发育研究及干细胞的研究。试验采用无缝克隆(In-Fusion PCR cloning)技术,将Oct4启动子序列直接重组到pEGFP-N1载体上,用Oct4代替质粒pEGFP-N1中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)原有的CMV启动子构建出Oct4-EGFP报告载体,并用脂质体转染技术转染入大白猪胎儿成纤维细胞中,分析Oct4-EGFP报告载体,表达情况。结果发现,经PCR及测序验证,成功构建了Oct4-EGFP多能性报告载体,并在孤雌囊胚上初步验证了载体的有效性;经过脂质体转染,经筛选及PCR鉴定,获得了8株整合有Oct4-EGFP多能性报告载体的转基因细胞。研究结果表明,运用无缝克隆技术可高效率构建Oct4-EGFP多能性报告载体,且获得的转基因阳性细胞可为猪胚胎早期发育和胚胎干细胞研究奠定技术基础。 相似文献
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构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。 相似文献
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貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。 相似文献