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1.
《中国兽医杂志》2019,(5)
为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。 相似文献
2.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(12)
为了建立特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,针对支原体ompA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立鹦鹉热嗜衣原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。并对来自宁夏地区三个规模化奶牛养殖场的376份流产奶牛样品利用鹦鹉热嗜衣原体IHA诊断试剂盒和TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR进行检测。结果表明:建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法敏感性为10 fg的总DNA,是一种可靠、快速、灵敏的检测鹦鹉热嗜衣原体的方法,并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本的检测。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2020,(7)
为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测盖塔病毒(Getah virus,GETV)的核酸,并初步应用于GETV的临床标本检测。根据GenBank登录的GETV全基因组序列,应用生物学软件进行序列比对,在NSP1保守区设计1对特异性引物和TaqMan探针。建立实时荧光定量RT-PCR检测GETV的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法能特异性地鉴别检测GETV;检测灵敏度高,检测的最低模板量可以达到2.03×10~1 copies/μL;将收集到的10 000只蚊子样品分成100份进行检测,共检测出8份GETV阳性样品,与常规反转录PCR(RT-PCR)检测及病毒分离结果吻合。本研究建立的GETV TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于GETV的临床早期诊断。 相似文献
4.
为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×102拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。 相似文献
5.
为利用TaqMan荧光定量PCR技术建立一种快速、敏感、特异的产气荚膜梭菌α毒素检测方法,根据产气荚膜梭菌各型之间共同的生物学特性,以编码产气荚膜梭菌α毒素的基因序列作为靶序列,设计1对引物和探针,分别以A、B、C、D 4个型的产气荚膜梭菌DNA为模板,通过优化引物、探针浓度和扩增条件,建立了TaqMan荧光定量PCR方法,同时对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了验证。结果显示:当上下游引物浓度和探针浓度均为0.25μmol/L时,Ct值最低;该方法与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等细菌均无交叉反应,具有良好的特异性;灵敏度高,对A型产气荚膜梭菌基因组DNA的最低检测限为9.1 pg/μL;重复性好,组内及组间试验标准差均小于0.4;对2023年收集的24份样品进行检测,发现本方法的阳性检出率(20.83%)与商品试剂盒一致。综上,本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异的TaqMan荧光定量PCR方法,可对产气荚膜梭菌α毒素进行快速检测,为防控产气荚膜梭菌病提供了有力的技术支撑。 相似文献
6.
犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R~2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。 相似文献
7.
鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
8.
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
9.
根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。 相似文献
10.
以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。 相似文献
11.
The study was aimed to establish a specific and sensitive TaqMan Real-time PCR assay for detection of Arcanobacterium pyogenes (A.pyogenes).Based on the conservative sequence of pyolysin (PLO) gene of A.pyogenes published in GenBank, specific primers and TaqMan probes were designed. The TaqMan Real-time PCR assay was established, and the specificity and sensitivity were tested.The specificity test results showed that only A.pyogenes exhibited typical curves.The detection sensitivity of this assay was 77.6 fg genomic DNA per 20 μL reaction, and 63 CFU/mL for pure cultures.16 out of 23 clinical samples were positive detected by the TaqMan Real-time PCR assay, which were consistent with API Coryne identification.The TaqMan Real-time PCR assay developed in this study was specific and sensitive for detection of A.pyogenes, and it could be used for identification and epidemiological investigation of A.pyogenes. 相似文献
12.
13.
ZHAO Xueli LIU Yi BAN Fuguo YAN Ruoqian WANG Huajun WANG Shujuan MA Zhenyuan WANG Dongfang 《中国畜牧兽医》2018,45(8):2086-2094
This study was aimed to establish a double TaqMan MGB Real-time PCR assay to simultaneously and specifically detect canine distemper virus (CDV) and canine parvovirus (CPV) in one reaction.Two pairs of specific primers for CDV and CPV,along with two TaqMan MGB probes for each virus were designed in the assay basing on CDV H gene and CPV VP2 gene sequences.The specificity,sensitivity and repetition of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay were tested,and 48 samples taken from clinic suspicious CDV and CPV infected canines had been testified by the established double TaqMan MGB Real-time PCR.The results indicated that the doulde TaqMan MGB Real-time PCR assay was successfully established,and the number of standard curve correlation (R2) of CDV and CPV were 0.997 and 0.993,respectively.The specificity of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay revealed that amplifications were showed on CDV and CPV samples,but other pathogens and negative controls had no amplifications;The sensitivity of CDV and CPV were both 10 copies/μL.Meanwhile,14 CDV positive samples,19 CPV positive samples and 4 CDV/CPV double positive samples were detected,which were consistent with the results of the sequencing.Therefore,the established double TaqMan MGB Real-time PCR assay had high sensitivity,specificity and flux accurate quantitative,which could be applied to clinical CDV/CPV infection each periods. 相似文献
14.
CAO Hui-hui SUN Wen-chao ZHENG Min WEI Xian-kai SU Jiao-xiu LIANG Sheng ZHENG Lie-feng LI Jun LIU Qi 《中国畜牧兽医》2015,42(10):2560-2566
To establishment a TaqMan Real-time PCR method for detection of duck poxvirus (DPV),we cloned the P4b gene of DPV.The specific primers and probe were designed according to the nucleotide sequence of avipoxvirus available in GenBank.Recombinant plasmid pMD-DPV-P4b was employed as positive standard template for Real-time PCR.By optimization of reaction conditions,a TaqMan Real-time PCR method for detection of DPV was established.The results of specificity test proved this method had no cross-react with other waterfowl vial agents and poxviruses including avian influenza virus,duck flavivirus,duck hepatitis virus,Newcastle disease virus,duck entertitis virus,goose parvovirus,goatpox virus and fowlpox virus.The detection limit of the assay was 1.29×102 copies/μL of viral DNA,which was 100 times higher than that of the routine PCR.Reproducibility test showed that the CVs of intra assay and inter assay were both less than 2%.Above results supported that the assay was suitable for the detection of DPV very well. 相似文献
15.
为建立检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的快速检测方法,本研究以VP toxR基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VP的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有VP检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为4.9 CFU/mL,利用该检测方法对采集的150份样品进行检测,共计检出3份VP阳性样品,与国标法(GB 4789.7-2013)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。 相似文献
16.
To establish a rapid assay for detection of Vibrio parahaemolyticus(VP), Real-time PCR method was developed targeting to toxR gene of Vibrio parahaemolyticus.The results showed that the test for 15 bacteria strains using the Real-time PCR method, only Vibrio parahaemolyticus test was positive, indicating that the method had high specificity.In addition, the sensitivity of Real-time PCR was 4.9 CFU/mL.Furthermore, a total of 3 positive samples for Vibrio parahaemolyticus were detected from 150 clinical samples by the Real-time method, which was in accordance with the testing result by GB 4789.7-2013 standard detection protocol.Therefore, the Real-time method provided a novel rapid and sensitive detection method with good practicality for Vibrio parahaemolyticus infection. 相似文献
17.
为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R2）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。 相似文献
18.
LI Dan-dan XU Yi-gang LI Meng-yuan WANG Yu QIU Suo-ping GAO Hui-jiang GAO Shen-yang 《中国畜牧兽医》2016,43(6):1453-1457
To establish a rapid assay for Listeria monocytogenes(LM) detection,a Real-time PCR method was developed targeting iap gene of LM.The results showed that the test for 15 bacteria strains,only LM was positive,indicated that the method had high specificity.In addition,the sensitivity of Real-time PCR was 6.5 CFU/mL.Stability and reproducibility of the test showed that the coefficient of variation for the same sample repeat the Ct values were less than 2%.Furthermore,a total of 3 positive samples for LM were detected from 139 clinical samples by the method,which was in accordance with the testing result by GB 478930-2010 standard detection protocol.Therefore,the Real-time PCR method provides a novel rapid,sensitive and good repeatability detection method for LM infection. 相似文献
19.
单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。 相似文献