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为了了解贵州地方猪肺炎支原体菌株遗传变异情况,试验对3份贵州省贵阳市某地方猪养殖场疑似感染猪肺炎支原体的病料进行离体培养及PCR鉴定;同时对分离菌株及6株疫苗菌株的主要黏附因子P46基因、P97基因R1区和P146基因高变区进行PCR扩增及测序,并与参考菌株比对分析,挖掘分离菌株与疫苗菌株、参考菌株之间的差异性。结果表明：从疑似病料中培养并鉴定获得1株猪肺炎支原体,命名为GZ株。GZ株P46基因核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株的同源性最高,均在98.3%以上。P146蛋白高变区氨基酸差异主要发生在PQ和PS重复区,GZ株PQ重复区中只缺失2个氨基酸,而PS重复区中缺失7个氨基酸,与疫苗菌株168L株、RM48株和Z株缺失情况一致。GZ株P97基因R1区核苷酸序列与疫苗菌株、参考菌株之间的同源性低,为94.5%～97.4%;各菌株间P97蛋白R1区氨基酸序列中,AAKPV/E重复基元存在不同程度缺失,GZ株在该区域仅存在5个重复基元,且第1个重复序列中的谷氨酸(E)突变为谷氨酰胺(Q)。说明P97蛋白R1区和P146蛋白高变区氨基酸序列的改变导致抗原表位和黏附能力发生变化,对P97基因R1... 相似文献
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从典型猪肺炎支原体病变肺组织传代分离到一株支原体,经培养特性、血清学鉴定、生化鉴定、PCR检测及测序分析证明其为猪肺炎支原体,纯化后命名为S株。将S株P46基因和P97基因R1区的氨基酸序列与其他菌种的相应序列进行同源性分析,该菌株P46基因氨基酸序列与其他菌种同源高达99%以上,P97基因R1区的氨基酸重复数为11个,不同于其他菌株;免疫原性试验结果表明该菌株具有良好的免疫原性。 相似文献
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猪肺炎支原体黏附因子基因R1R2区的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank登录的猪肺炎支原体232株P97基因和J株黏附因子基因设计了1对引物，以我国猪肺炎支原体Z株(强毒株)基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增了该株黏附因子基因的部分序列。经序列分析后，重新设计了1对带有EcoRI和HindⅢ酶切位点的引物，并经引物的定点突变，PCR扩增了Z株黏附因子的R1R2区。扩增产物经双酶切后克隆到表达载体pET-32(a) 中。该重组质粒经酶切鉴定后，将其具有正确阅读框架的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃下经IPTG诱导表达，得到相对分子质量约29000的融合蛋白，表达量约为11％。 相似文献
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猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较 总被引：1，自引：0，他引：1
猪肺炎支原体(Mycoplasma Hyopneumoniae,Mhp)兔化弱毒株R659株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株232,通过A26培养基培养,提取DNA;利用PCR技术从四株猪肺炎支原体中均能扩增出目的条带.将该序列克隆到pGEM-T-Easy载体上测序.结果表明,克隆序列全长1 152 bp,编码383个氨基酸和一个终止子(TAA);该序列中含有3个TGA编码Trp,而不是终止密码子.比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株232及NCBI上发布的J株的P46基因序列,发现它们的同源性分别为98.6%、99.2%、99.2%;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为98.7%、99.2%、99.2%.结果表明猪肺炎支原体的P46基因在猪肺炎支原体种内是很保守的,因此建立以P46蛋白为诊断抗原的ELISA具有潜在的意义. 相似文献
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采用气管结扎、链霉蛋白酶灌注冷消化法分离猪气管上皮细胞,并以对数生长期的猪肺炎支原体(Mhp)感染猪气管上皮细胞,通过间接免疫荧光技术定性定量研究不同滴度的猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附及相同滴度的猪肺炎支原体随时间变化对猪气管上皮细胞的黏附。结果表明,分离的猪气管上皮细胞存活率为95%以上,广谱角蛋白染色阳性;Mhp野毒株XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用30min就能看到少量的支原体黏附,作用4h以上时黏附更明显,并且,二者作用1、2、4、6、10h,XLW-1对猪气管上皮细胞的黏附与阴性对照相比差异极显著(P0.01);1×107、2.5×106 CCU/mL的XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用6h,能看到支原体黏附于细胞表面,并且与阴性对照相比差异极显著(P0.01),而其他低滴度的XLW-1则看不到黏附。 相似文献
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为了确诊猪伪狂犬病病毒(PRV)的感染,探讨目前广西猪群中流行的PRVgE基因的变异特征,为更好地防控猪伪狂犬病(PR)提供参考依据,本研究采集了广西陆川某猪场保育猪群发生呼吸道症状的肺脏组织,并用Vero细胞进行病毒分离,应用PCR方法对分离株的gE基因进行克隆和测序,根据测序结果证实分离到1个PRV毒株,命名为GXLC1。分离株在Vero细胞上增殖,细胞出现典型的病变;GXLC1株gE基因与GenBank上20株国内外具有代表性参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%,氨基酸同源性为94.3%~99.6%;gE基因的遗传进化分析显示,GXLC1株与2012年的国内流行毒株亲缘关系较近,与欧美分离株亲缘关系较远;氨基酸序列分析显示,GXLC1株gE蛋白主要抗原表位区较之国内经典强毒株有3个氨基酸位点的变异,可能导致gE抗原性发生改变。本研究将分离到的1个PRV毒株进行了gE基因的分析,发现GXLC1株为近年来流行的变异株,gE蛋白在抗原表位区上有3个氨基酸位点的变异,这是否会影响GXLC1株毒力和抗原性的变化,还有待进一步研究;对gE基因变异特征的分析和病毒的分离为进一步丰富广西PRV的分子流行病学和疫苗的研制提供参考依据和重要材料。 相似文献
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根据GenBank中猪肺炎支原体P97基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体168弱毒株特异性黏附因子P97抗原决定簇基因部分序列,经测序确认后,克隆入原核表达载体pET-32a,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTG诱导,通过SDS-PAGE进行鉴定,Western blot证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件。 相似文献
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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplsamal pneumonia of swine,MPS)的原发性病原,广泛流行于世界各地,对养猪业造成重大经济损失。MPS发病率高,死亡率低,主要导致猪慢性咳嗽,生长率降低,饲料转换率下降,体重增长缓慢。另外,MPS使宿主易感其他呼吸系统病原,从而造成继发感染。由于对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白缺少深入研究,使得Mhp研究受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。文章围绕Mhp主要黏附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要保护性抗原蛋白予以综述,以期为MPS疾病诊断、监测和相关疫苗研究提供科学依据。 相似文献
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LI Ke-yu ZHAO Wu LI Bin QIN Yi-bin LU Bing-xia LIANG Jia-xing HE Ying ZHOU Ying-ning WEI Ying-yi 《中国畜牧兽医》2015,42(9):2270-2277
Through in-depth understanding of sequence characteristics, structure and genetic variation of adhesion factor P97 gene R1 region of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) epidemic strains in Guangxi Luchuan pig, the assay was aimed to provide theoretical basis for mycoplasmal pneumonia of swine (MPS) integrated effective prevention and control measures of Guangxi local variety Luchuan pig, and lay a solid foundation for further study the characteristics of Mhp epidemic strains in Guangxi Luchuan pig.A pair of primers was designed to amplify P97 gene R1 region according to Mhp genome sequence, the MPS positive disease materials of Guangxi Luchuan pig from 2011 to 2014 as the object of study, after genomic DNA extraction and PCR amplification of P97 gene R1 region, the PCR products were sequenced.The base composition and deduced amino acid sequence of P97 gene R1 region of Mhp epidemic strains of Guangxi Luchuan pig were compared.The analysis of DNAStar showed that there were multiple base mutations in P97 gene R1 region of 15 strains of Guangxi Luchuan pig Mhp strains (GXLC-1, GXLC-2, GXLC-3, GXLC-4, GXLC-5, GXLC-6, GXLC-7, GXLC-8, GXLC-9, GXLC-10, GXLC-11, GXLC-12, GXLC-13, GXLC-14 and GXLC-15) and 3 strains of Guangxi other breeds of pigs Mhp strains (GX227, GX595 and GX674).The statistical repeat number of five amino acid (AAKPV/E) of P97 R1 region were 9 to 18, the average value was 12, TN repeats were 1 to 4.We found that Guangxi Luchuan pig Mhp strains mutation made its virulence and adhesion ability enhancement, and respiratory of Luchuan pig with the special structure of short and narrow, which could more easily lead to the occurrence of Guangxi Luchuan pig MPS. 相似文献
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In order to understand the sequence characteristics, basic structure and genetic variation of P46 gene which was the main immunogenic surface membrane protein gene of local prevalent Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) strains in Guangxi Luchuan pig.The Mhp P46 gene in positive diseased swine samples which were collected from the purebred Luchuan pig farms in Guangxi from 2011 to 2013 was amplified using PCR,and then cloned into pMD18-T vector and transformed into E.coli DH5α.We chose the positive clones and sequenced.We amplified P46 genes of four positive strains (GXLC1,GXLC2,GXLC3 and GXLC4).Use the DNAStar software to analyse the cloned sequence.The results showed that P46 gene sequence was 1104 bp coding 368 amino acids.The sequence included three Trps coded by TGA codons which weren’t termination codons and one Arg coded by CGG codons which weren’t nonsense code.The homologies of nucleotide sequences of 4 strains were 98.4% to 99.4%,and the homologies of deduced amino acid sequences were 98.6% to 99.5% with these sequences of standard J strain,232 strain,7448 strain and 168 strain.The P46 genes of these strains had highly conservation because of the high-level homologies. 相似文献
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猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
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试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999 bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906 bp处为同义突变,110和278 bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。 相似文献
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FENG Wen-wu SUN Zhen-mei LI Peng-cheng DING Mei XU Hou-qiang ZHAO Jia-fu CHEN Xiang 《中国畜牧兽医》2016,43(4):906-912
In order to study phosphotyrosine interaction domain containing (PID1) gene of Baixi pig, it was amplified and sequenced by Nest PCR and T clone technology.Then the functions and the genetic evolutionary relationships of the gene and its predicted protein were analyzed by bioinformatics software.The results showed that the whole CDS region of PID1 gene was 654 bp, which encoded 217 amino acids.The results of sequence alignments showed that Baixi pig shared 98.2% and 97.7% similarities of amino acid with which of Shandong Laiwu pig and Guangxi Luchuan pig.The phylogenetic tree indicated that Baixi pig kept away from these two pigs.The results of sequence alignments among species showed that Baixi pig shared 96.6%, 96.6%, 96.3%, 95.0%, 93.9%, 91.7%, 90.8%, 88.2%, 69.7% and 67.3% similarities of amino acid with which of Bos taurus, Bos grunniens, Macaca mulatta, Mus musculus, Ophiophagus hannah, Homo sapiens, Gallus gallus, Xenopus laevis, Rattus norvegicus and Danio rerio.Phylogenetic analysis indicated that PID1 gene was highly conserved in the process of evolution of different species.The protein structure analysis results showed that the mainly function region of PID1 gene was PTB structural domain, which was located in the C-terminal sequence of the PID1 protein.In this study, we successfully cloned PID1 gene of Baixi pig, which laid the foundation for further study in intramuscular fat deposition and development of resources. 相似文献
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对自海南省、广西省发生鸡传染性支气管炎 (IB)鸡群分离的 4株 IBV分离株 (Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98、GX- 2 /98)的主要免疫原纤突蛋白 S1基因经 RT- PCR扩增其 5′端约 1.2 kb的目的片段 ,将其插入载体 p MD 18- T中 ,在大肠杆菌中实现目的基因的克隆。对克隆的目的基因经限制性酶切分析及 PCR鉴定后 ,以双脱氧链终止法测定其核苷酸序列 ,并与 Gen Bank中的参考毒株 (H12 0、SD- 1/97和 Holte)相应序列作比较 ,分析其同源性。结果表明 ,Ha N- 1/95、Ha N- 2 /95、GX- 1/98及 SD- 1/97与疫苗株 H12 0的核苷酸序列同源性分别为 99.5 %、99.2 %、97.9%和99.5 % ,其推导氨基酸序列同源性分别为 99.1%、98.9%、96 .9%和 99.2 %。 GX- 2 /98与 Holte株的核苷酸序列同源率为 99.0 % ,其推导的氨基酸序列同源性为 98.6 % ,而与其他中国分离株的核苷酸序列的同源性仅为 70 %左右 ,氨基酸序列的同源性仅为 6 8%左右。 相似文献
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本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。 相似文献
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为了解牛乳头瘤病毒1型（bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1）广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945 bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株（M20219.1）、BPV-13型参考株（JQ798171.1）同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。 相似文献
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GUAN Zhi-hui CHEN Bao-jian PAN Tian-biao QIN Zhao-xian LIU Jia-qi MA Qing-yan NONG Su-qun XIE Bing-kun 《中国畜牧兽医》2017,44(3):628-634
The objective of this study was to clone the acyl-coenzyme A oxidase 1 (ACOX1) gene of Luchuan pig and analyze its genetic structure with bioinformatics. A pair of special primer was designed according to predicted sequence of pig ACOX1 gene in GenBank. The ACOX1 gene was amplified by RT-PCR, the physicochemical property and secondary structure of ACOX1 gene were systemically analyzed by bioinformatics techniques. The results showed that ACOX1 gene fragment included an 1 986 bp whole length CDS (coding 661 bp amino acids). The sequence multi-aligned results showed that Luchuan pig shared 99.5%, 85.5%,87.1%,66.3%,75.6%,84.0%,82.3%,81.1% and 69.1% of similar nucleotide sequence with that of pig,human, zebrafish, chicken, rhesus monkeys, mice, rat and frog, respectively. The prediction of ACOX1 secondary structure showed that Luchuan pig ACOX1 had no signal peptide and transmembrane structure. This study suggested that the whole CDS sequence of ACOX1 gene was successfully cloned in Luchuan pig, and the cloning and analysis of ACOX1 gene provided an important foundation for further studying on the fatty deposition and lipornetabolism of ACOX1 gene in Luchuan pig. 相似文献