共查询到20条相似文献，搜索用时 218 毫秒
1.
为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
2.
为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。 相似文献
3.
PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表达与重组蛋白的纯化 总被引：31，自引：0，他引：31
为成功表达猪繁殖与综合征病毒(PRRSV)结构蛋白GP5，通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF5扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5)。将d ORF5克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了重组蛋白GST-dORF5，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为20．8％。Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。利用融合肽进行亲和层析得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究PRRS病毒结构蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献
4.
通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF3扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF3(deleting ORF3)。将dORF3克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在E.coli BL21细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF3，表达产物以包涵体的形式存在，表达量为30．6％，Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRS病毒次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础。 相似文献
5.
PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
6.
为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
7.
根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。 相似文献
8.
通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMDl8一T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p—1,构建原核重组质粒（pGEx—GPS）,转化至E．coli B1221感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。 相似文献
9.
为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
10.
为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白单克隆抗体,首先构建猪PRRSV GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,将其作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫4次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建PRRSV GP5基因的原核重组表达载体pGEX-6P-GP5,将其转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原,通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。本研究成功构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,表达并纯化了GP5蛋白。经2~3次亚克隆后获得3株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株,IFA和Western blot对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。 相似文献
11.
利用已克隆的BALB/c小鼠Doppel蛋白基因,将其成熟蛋白编码区亚克隆至表达载体pGEX-6P-1上,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-PRND。将重组蛋白表达载体转入E.coli BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果表明,BALB/c小鼠Doppel蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。对表达的蛋白进行提取和纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,初步建立了小鼠睾丸Doppel蛋白组织学分布的免疫组织化学方法。为进一步研究Doppel的结构、功能及其在TSEs发生发展中的作用提供基础材料和数据。 相似文献
12.
马动脉炎病毒N蛋白基因GST融合表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：1，他引：0
采用RT-PCR方法扩增出马动脉炎病毒核衣壳蛋白基因0RF7,并将其克隆到pMDl8-T载体,构建成重组质粒pMDl8-N,在上海生物工程公司测序。结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与EAVNC-002532株的同源性为99％。表明0RF7是EAV基因组内的保守序列,将0RF7亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组质粒pGEX-6P-N,用pGEX-6P-N转化表达菌株BL21（DE3）,诱导表达后SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,克隆在谷胱苷肽硫转移酶（GST）下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-N分子质量约为40ku,为马动脉炎病毒病血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
13.
14.
传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。 相似文献
15.
经RT-PCR扩增了SARS冠状病毒（SARS-CoV）BJ01株的PU5基因（putative uncharacterized gene5）的cDNA，将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，命名为pGEX-PU5，测序正确后将阳性质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，表达的融合蛋白命名为pGEX-PuP5，并用Glutathione Swpharose^TM 413亲和层析柱对表达产物进行纯化，然后用PreScission^TM Protease酶对融合蛋白进行解离，获得PUP5蛋白，用抗SARS-CoV卵黄抗体IgY和GST-tag单克隆抗体分别对表达的目的蛋白做Western blot鉴定，证明所表达的蛋白具有免疫学活性。本研究应用原核表达系统表达了PUP5蛋白，为进一步解析该蛋白功能奠定了基础。 相似文献
16.
猪蓝耳病病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的建立及初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据PRRSV VR-2332株序列设计了1对扩增PRRSV N蛋白基因的特异性引物,从PRRSV北方株感染细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得长约372 bp的N蛋白编码基因片段。将其克隆到pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pPRRS-N。重组基因在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为41 000的融合蛋白,目的蛋白表达量约占菌体蛋白的28.5%。利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对本方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区13个养猪场的260份血清,结果表明,本方法的敏感性和特异性分别为93.5%和86.7%,与IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测结果的符合率达到91.5%。 相似文献
17.
18.
应用RT-PCR技术,利用含有酶切位点的上、下游引物扩增得到Vero E6细胞中编码B23.1蛋白的基因片段,并进行序列测定及分析,结果表明,B23.1基因含有一个长901 bp的开放阅读框(ORF),未发现碱基的插入和缺失。将其进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,而后定向克隆到经相同双酶切的pGEX-6p-1载体中,构建的重组质粒命名为pGEX-6p-B23.1;将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明,表达出与预期大小相符的约68 ku的重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting分析结果表明,表达的重组蛋白与B23蛋白单克隆抗体有很好的反应活性。 相似文献
19.
利用PCR技术亚克隆了H7亚型禽流感病毒的HA1基因,并将PCR产物连接到克隆载体pMD 18-T Simple vector,转化大肠杆菌。测序结果表明所克隆的片断大小为1035bp。将HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-HA1。将构建好的融合表达载体在IPTG的诱导下在大肠杆菌中得到了表达。融合蛋白GST-HA1的分子量为63ku。Western-Blot和ELISA鉴定结果表明,融合蛋白与H7亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,而与H5、H9亚型抗血清不发生反应。 相似文献
20.
为表达麻鸭白介素17(duIL-17),本研究提取ConA刺激的麻鸭脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增duIL-17基因片段,将该片段插入克隆载体pCR2.1中构建重组质粒pCR2.1-duIL17.将duIL-17基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-duIL17,将其转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达.测序结果显示,duIL-17与参考序列(EU366165.1)相比较第174位碱基由C突变为T,并且为沉默突变.SDS-PAGE和western blot分析显示,诱导表达的重组蛋白GST-duIL17主要以包涵体形式存在,分子量大小约为45 ku,duIL-17与抗鸡IL-17抗体具有良好反应性.本研究为制备duIL-17单克隆抗体提供了实验依据. 相似文献