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1.
为研究大肠杆菌多价噬菌体Bp7的尾丝蛋白gp37在噬菌体宿主识别中的作用,通过PCR扩增噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的C末端基因,构建原核重组表达质粒pGEX-6p-1-gp37,并转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达。以鉴定正确的融合表达蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并检测抗血清对噬菌体增殖作用的影响。结果显示:经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签67ku的融合表达蛋白;抗Bp7尾丝蛋白gp37的抗血清可明显抑制噬菌体Bp3、Bp7的增殖(P<0.05),对噬菌体Bp2、Bp5、Bp6的增殖具有抑制作用,但差异不显著(P<0.05),该抗血清对噬菌体Bp4的增殖反而具有促进作用。试验结果证实gp37参与噬菌体Bp7的宿主识别。 相似文献
2.
裂解性噬菌体能够特异性裂解细菌,本研究分析了一株从自然界中分离的宽宿主谱裂解性大肠杆菌噬菌体的种属和进化关系。前期用Adams双层平板琼脂法从猪场污水中分离纯化出一株裂解性噬菌体v B_Eco M_JS09,裂解谱分析能够裂解禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌。扩增分析gene18、gene 23序列,并根据gp18和gp23氨基酸序列构建系统进化树,分析JS09的遗传进化关系。结果表明噬菌体v B_Eco M_JS09基因组为ds DNA,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、T4-like噬菌体、T-evens亚群。其gp18氨基酸序列与大肠杆菌噬菌体RB69同源性最高,为100%;gp23氨基酸序列与大肠杆菌T4噬菌体同源性最高为96%。该结果为禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌的防控提供了生物学基础。 相似文献
3.
《畜牧兽医学报》2018,(11)
为了研究噬菌体Bp7蛋白gp38在噬菌体吸附宿主菌过程中的作用,PCR扩增gp38基因,对gp38蛋白氨基酸序列特征进行分析和同源性比对,构建重组表达质粒pColdTF-gp38,在E.coli BL21中诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot检测重组蛋白gp38的表达;亲和层析法纯化蛋白,制备gp38多克隆抗体。免疫电镜检测gp38在噬菌体Bp7表面的定位,蛋白竞争试验和抗体阻断试验测定gp38及其抗体对噬菌体Bp7吸附效率的影响。序列分析结果表明,gp38蛋白氨基酸序列与T4噬菌体无同源性,与噬菌体T2、T6有同源性,C端序列保守区与高变区间隔排列,呈现马赛克特征;构建的重组质粒pColdTF-gp38在E.coli BL21实现可溶性表达,制备的gp38多克隆抗体效价达1∶16;免疫电镜检测结果表明,gp38蛋白抗体能够与长尾丝结合,引起噬菌体Bp7的聚集;蛋白竞争试验和抗体阻断试验结果表明gp38蛋白及其抗体均能完全抑制噬菌体Bp7对宿主菌E.coli K12的吸附。以上研究结果表明,gp38是噬菌体Bp7的尾丝蛋白,位于长尾丝末端,作为受体识别蛋白在噬菌体Bp7吸附宿主菌过程中具有关键作用,这为进一步阐明宽宿主谱噬菌体Bp7识别受体的机制提供了理论基础。 相似文献
4.
此前本实验室从健康猪肠道及粪样中分离纯化得到57株大肠杆菌噬菌体，发现其中有12株噬菌体可裂解产肠毒素大肠杆菌（ETEC），本研究旨在探究这些大肠杆菌噬菌体的宿主谱及抑菌效力，以期了解肠道内大肠杆菌噬菌体对机体的保护作用。以89株大肠杆菌为宿主菌（其中包括5株ETEC），采用点滴法、双层平板法和液体扩增法测定噬菌体的宿主谱，利用浊度法测定噬菌体对ETEC的抑菌效力，并对噬菌体分类进行鉴定。12株噬菌体均能裂解一种或多种ETEC，但是均无法通过感染ETEC而增殖。S143_1、S143_2、S144_2、S35、S86_1、L86及S172等7株噬菌体虽然无法通过ETEC产生子代噬菌体，但在感染复数（MOI）为10或100时仍对ETEC具有显著的抑菌效力。12株噬菌体中有8株为T4样噬菌体，其他4株噬菌体均属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。本研究从猪肠道内分离到12株大肠杆菌噬菌体，虽然无法感染ETEC，但仍可裂解ETEC，其中，7株在MOI为10或100时可有效地抑制ETEC生长。 相似文献
5.
《畜牧兽医学报》2020,(7)
此前本实验室从健康猪肠道及粪样中分离纯化得到57株大肠杆菌噬菌体,发现其中有12株噬菌体可裂解产肠毒素大肠杆菌(ETEC),本研究旨在探究这些大肠杆菌噬菌体的宿主谱及抑菌效力,以期了解肠道内大肠杆菌噬菌体对机体的保护作用。以89株大肠杆菌为宿主菌(其中包括5株ETEC),采用点滴法、双层平板法和液体扩增法测定噬菌体的宿主谱,利用浊度法测定噬菌体对ETEC的抑菌效力,并对噬菌体分类进行鉴定。12株噬菌体均能裂解一种或多种ETEC,但是均无法通过感染ETEC而增殖。S143_1、S143_2、S144_2、S35、S86_1、L86及S172等7株噬菌体虽然无法通过ETEC产生子代噬菌体,但在感染复数(MOI)为10或100时仍对ETEC具有显著的抑菌效力。12株噬菌体中有8株为T4样噬菌体,其他4株噬菌体均属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。本研究从猪肠道内分离到12株大肠杆菌噬菌体,虽然无法感染ETEC,但仍可裂解ETEC,其中,7株在MOI为10或100时可有效地抑制ETEC生长。 相似文献
6.
为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。 相似文献
7.
《家畜生态学报》2021,42(7)
为了解撒坝猪源大肠杆菌噬菌体分离株的生物学特性。自撒坝猪源大肠杆菌中分离到一株裂解性噬菌体,利用PCR扩增噬菌体衣壳蛋白gp23基因,并通过同源性比对及遗传进化分析来鉴定噬菌体。经增殖纯化培养后测定噬菌体的效价和对菌株的裂解效应,而后测定其最佳感染复数、热稳定性、pH稳定性及绘制生长曲线以探究该噬菌体的生物学特性。结果表明,分离株衣壳蛋白gp23基因与噬菌体slur14亲缘关系最近,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科T4-like噬菌体;分离株具有较高的效价,达8.67×10~9 pfu/m;针对实验室保存的92株已确定血清型的大肠杆菌裂解率为61.95%,完全裂解率为27.17%;在60℃条件下作用30 min,或在pH5和pH9时,噬菌体的效价表现明显下降;生长曲线绘制后可知该噬菌体感染宿主菌的潜伏时间约为30 min,爆发时间约为120 min,裂解量为41 pfu/cell。该试验成功分离得到裂解能力较强、裂解谱较广且对理化因素耐受力较强的T4-like噬菌体。 相似文献
8.
9.
DNA旋转酶基因gyrA中喹诺酮耐药决定区碱基变换在大肠杆菌对喹诺酮的耐药性方面起着十分重要的作用.采用PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)技术可对大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变进行有效检测.本文以142株猪源致病性大肠杆菌氟喹诺酮药物敏感菌株为样本,测定了细菌对喹诺酮药的MIC值,结果表明142株猪源大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率分别为78.8%,56.3%,65.5%,76.8%.猪源大肠杆菌对氟喹诺酮药物的耐药率高,且耐药菌株MIC值较大.菌株WJPE2-1(对环丙沙星的NIC为0.5μg/mL)的诱导耐药试验,结果表明,在通过药物浓度梯度连续诱导过程中获得了MIC为2,8,64,128μg/mL的四株诱导菌株,诱导菌株4对ENR、NOR、OFL、CIP的MIC值分别增加到诱导前的32,128,128,256倍,且4株诱导菌株对CIP、ENR、NOR、OFL的MIC值均呈现递增.根据GenBank注册的大肠杆菌gyrA序列设计引物,横跨gyrA的第40和118密码子位置,包含完整的QRDR,从27株不同MIC值的大肠杆菌株、ATCC25922、4株诱导耐药菌株均获得约300bp的PCR产物.采用291的交联度、12%的聚烯酰胺浓度,1×TBE,凝胶中添加5%的甘油的条件,对诱导菌株、药物敏感菌株及不同耐药水平的分离菌株进行SSCP分析,结果表明,诱导菌株的谱型与敏感对照菌不同,低MIC值菌株SSCP谱型与敏感对照与敏感对照一致性高;耐药菌株的谱型多数与敏感对照不同.四株诱导大肠杆菌PCR产物的SSCP谱型均与对照不一致,检出率为100%;27株不同耐药性的猪源大肠杆菌中,7株敏感大肠杆菌共有6株的SSCP谱型与标准敏感菌株对照一致,符合率为85.7%;20株耐药大肠杆菌其谱型与标准敏感对照一致的菌株为2株,检出率为90.0%.序列比较结果表明,敏感菌株WJPE2-1的PCR产物与敏感对照有2个碱基(第91,111位氨基酸残基位置)的差异,序列同源率为99.16%(236/238).诱导菌株1与2表现在第83位氨基酸编码序列由tcg突变为ttg,菌株3、4与菌株1、2的差异表现在第87位氨基酸编码序列由gac突变为tac.进一步分析发现,菌株WJPE2-1在第91位及111位的突变均为同义突变,即密码子的变换没有引起氨基酸残基的改变.在诱导菌株中,1与2的gyrase的第83位氨基酸残基由Ser→Leu,菌株3、4的gyrase还在第87位氨基酸残基由Asp→Tyr.表明由于QRDR内碱基的改变,引起DNA旋转酶氨基酸的变化,导致大肠杆菌产生氟喹诺酮药物的耐药性. 相似文献
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本研究以K1荚膜大肠杆菌DE058（avian pathogenic Escherichia coli）为宿主菌,从鸡粪中分离烈性噬菌体PNJ1809-36并对其进行生物学特性的研究和基因组测序及分析。将噬菌体PNJ1809-36进行分离纯化,通过形态学观察、最佳MOI测定、一步生长曲线测定、温度和酸碱耐受性测定、体外裂解能力测定以及全基因组测序及分析来研究该噬菌体的生物学特性和基因组特征。结果显示：噬菌体PNJ1809-36能够形成清晰透明的噬菌斑,其电镜照片显示为具有收缩尾部的肌尾科噬菌体;宿主谱分析结果显示,该噬菌体能够特异性裂解具有K1荚膜的大肠杆菌;最佳MOI为0.01;一步生长曲线结果显示,其潜伏期为10 min,爆发期为40 min;噬菌体PNJ1809-36在40和50℃下存活良好,60℃ 30 min可使噬菌体完全失活;噬菌体在pH3~11之间均可存活,最适pH为6;体外裂解试验表明,该噬菌体可在6 h内完全抑制宿主菌的生长。经基因组测序与分析,噬菌体PNJ1809-36基因组全长为152 343 bp,GC含量为39.11%,含有277个开放阅读框（ORF）,11个tRNA基因。同源性分析显示其与早期发现的K1特异性的短尾噬菌体（如K1F、K1E）的同源性较低,而与噬菌体nepoznato、PVP-SE 1和phAPEC8等K1特异性噬菌体同源性较高,基因序列相似性达90%。噬菌体PNJ1809-36是一株特异性识别K1荚膜大肠杆菌的烈性噬菌体,属于肌尾科噬菌体新的系统发育分支。其针对K1荚膜的特性,提示该噬菌体在鉴定K1型大肠杆菌和治疗K1型大肠杆菌引起的疾病方面存在潜力。 相似文献
11.
本试验旨在研究肉种鸡饲粮中添加不同水平肌苷酸(IMP)对生长后期(22~42日龄)子代生长性能和血清生化指标的影响。试验选取遗传背景相同、体重相近的20周龄健康爱拔益加(Arbor Acres)肉种鸡480只,随机分为4组,Ⅰ组(基础日粮)、Ⅱ组(基础日粮+0.2%肌苷酸)、Ⅲ组(基础日粮+0.5%肌苷酸)和Ⅳ组(基础日粮+1%肌苷酸)。子代肉鸡根据肉种鸡饲粮中肌苷酸添加情况相应分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组,每组6个重复,每个重复80只,子代肉鸡仅饲喂基础日粮,试验期为子代肉鸡22~42日龄。结果显示:与Ⅰ组相比,22~42日龄子代肉鸡各组生长性能无显著差异(P>0.05);在子代肉鸡42日龄时,与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅳ组子代肉鸡血清中总蛋白(TP)的含量显著提高(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅲ组、Ⅳ组血清中低密度脂蛋白(LDL-c)含量显著提高(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅳ组血清中甘油三酯(TG)含量显著降低(P<0.05)。以上结果表明,肉种鸡饲粮中添加肌苷酸对子代生长性能无显著影响,但饲粮中添加0.2%肌苷酸可显著提高生长后期子代血清中TP的含量,降低TG的含量,添加0.5%和1%肌苷酸可显著提高生长后期子代血清中LDL-c含量,且添加1%肌苷酸可显著提高TP含量。 相似文献
12.
为建立牛的主要疫病的快速、准确及高通量鉴别诊断技术,以赤羽病病毒(AKV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)5种牛传染病病原为研究对象,将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合,建立了相应的基因芯片检测技术,并优化了该基因芯片的反应条件。结果表明,建立的基因芯片可同时检测上述5种病原,特异性好,60 min反应时间即可给出检测结果。其中AKV和PPRV的敏感性为10~3 copies/μL,BLV的敏感性为10~5 copies/μL,BTV和BVDV的敏感性为10~2 copies/μL,与LAMP检测的敏感性一致。成功建立了基于LAMP技术的5重RT-LAMP基因芯片,可同时快速准确检测上述5种病毒,为口岸检疫探索出一种能快速、高通量检测动物疫病的方法。 相似文献
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根据GenBank中已发布的血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)基因序列,针对VP1基因序列的保守区域设计一对引物及一条特异性TaqMan探针建立了DHAV-3的TaqMan荧光定量检测方法(TaqManRT-qPCR)。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的TaqManRT-qPCR方法在6.39×10^8~6.39×10^0拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,R2值为0.999。该方法能特异地检测出DHAV-3,与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)及其他常见鸭病病原无交叉反应,且组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。用普通RT-PCR方法和建立的TaqManRT-qPCR方法,对63份临床疑似鸭肝炎的肝组织样品进行检测,结果RT-PCR方法检出DHAV-3的阳性率是34.92%(22/63),TaqManRT-qPCR方法检出的阳性率是41.27%(26/63);对49份DHAV-3感染康复鸭的肛拭子样品进行检测,RT-PCR和TaqManRT-qPCR方法检出阳性率分别为22.45%(11/49)和85.71%(42/49);用TaqManRT-qPCR方法和鸡胚半数致死量法(ELD50)对DHAV-3(SD70株)鸡胚病毒含量进行检测比较,两种方法检测结果呈正相关。结果表明所建立的TaqManRT-qPCR检测方法特异性好,灵敏度高,为DHA-3快速诊断和流行病学调查提供技术手段。 相似文献
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在改进沙门菌分离方法的基础上,分离并鉴定深圳市动物肉源沙门菌,并进行耐药性分析。结果:采集自深圳地区的1 055个动物肉源样品的沙门菌总阳性率为21. 04%,其中:鸡肉(28. 71%)>猪肉(24. 95%)>牛肉(15. 00%)>虾肉(2. 82%)。基于最小抑菌浓度(MIC)测定去除重复的耐药表型,得到370株非重复沙门菌株;其中的75. 2%多重耐药,53株(14. 10%)表现ACSSuT^R耐药表型。经血清型鉴定,得到38种血清型及327株确定血清型的沙门菌,优势血清型包括Derby、1,4,[5],12: i: -、Rissen、Agona和8,20: z23,z4: -。在分离动物肉源沙门菌的过程中,四硫酸盐肉汤(TT)相比于氯化镁孔雀绿肉汤(RV)更有效。本研究表明,深圳地区动物肉源样品中,沙门菌分离率鸡肉和猪肉高于牛肉和虾肉,血清型以Derby、1,4,[5],12: i: -、Rissen、Agona和8,20: z23,z4: -为主,且多重耐药比例较高。 相似文献
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为保存江苏地方猪种的种质资源,通过采集猪耳结合低温运输进行老年猪耳组织块贴壁培养,建立猪耳成纤维细胞,进而将细胞扩繁传代并冷冻保存。通过规范采样流程,结合低温运输方式,使运输时间达到8h以上,扩大了采样范围,同时,使污染风险由前期的30.77%(13头)降低到目前的8.3%(12头)。虽然老年猪耳成纤维细胞在初期游离到铺满培养瓶需要21d,远高于胎儿(怀孕24d的胚胎)成纤维细胞,但其后期的冻存与解冻培养均不受影响。随后,利用手工克隆技术生产克隆胚胎,老年猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(27.04±4.08)%与新生猪耳成纤维细胞作为供体囊胚率(28.8±2.37)%相比,无显著差异(P>0.05)。本试验结果证明老年猪耳成纤维细胞培养及冻存的可行性,为利用体细胞与体细胞核移植对地方猪种种质资源的保存提供支持。 相似文献
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旨在探索组蛋白去乙酰化酶1 (histone deacetylase 1,HDAC1)和组蛋白去乙酰化酶2 (histone deacetylase 2,HDAC2)在卵母细胞减数分裂期组蛋白去乙酰化过程中的作用。首先利用免疫荧光技术,检测HDAC1与HDAC2在体细胞及卵母细胞不同时期的表达分布,然后分别利用抑制剂抑制HDAC1和HDAC2的活性,观察其对卵母细胞组蛋白去乙酰化的作用。结果:HDAC1与HDAC2分布在间期的体细胞和卵母细胞的细胞核中,但分裂期细胞中只有卵母细胞染色体上存在HDAC1的表达,抑制酶活性后该HDAC1的表达也消失;在小鼠卵母细胞第一次减数分裂双线期(germinal vesicle stage,GV期)卵母细胞体外成熟液中添加TSA (trichostatin A,HDACs广谱抑制剂)、Pyroxamide (HDAC1特异性抑制剂)、Santacruzamate A (HDAC2特异性抑制剂),发现Pyroxamide和Santacruzamate A均能显著抑制卵母细胞减数分裂过程中组蛋白乙酰化修饰的去除,但未能达到广谱抑制剂的抑制效果。研究表明,小鼠卵母细胞在减数分裂组蛋白去乙酰化过程中,HDAC1和HDAC2均具有组蛋白去乙酰化的作用,且与HDAC2相比,HDAC1发挥着主要的去乙酰化作用,这为组蛋白去乙酰化作用机理提供理论参考。 相似文献
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旨在研究白藜芦醇(RES)对猪卵母细胞体外老化的影响及机制。添加不同浓度RES(0、1、2、4μmol/L),体外培养猪卵母细胞44 h后,通过卵丘扩散和第一极体排出率筛选出最佳有效浓度为2μmol/L。卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)成熟培养44 h作为对照组,连续培养68 h作为体外老化组,置于含2μmol/L白藜芦醇成熟培养液中培养68 h,为白藜芦醇处理组。激光扫描共焦显微镜检测染色体和纺锤体,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平。结果表明:RES处理组和对照组的猪卵母细胞染色体与纺锤体异常率均较老化组显著降低(P<0.01)。用2μmol/L RES处理后,猪卵母细胞Caspase-3和Bax蛋白表达量均有下降,显著低于老化组(P<0.001);Bcl-2蛋白表达量有所升高,但差异不显著。试验表明,RES可明显抑制猪卵母细胞的老化,这一作用可能主要通过抑制线粒体凋亡途径来实现的。 相似文献
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致仔猪脑膜炎猪链球菌的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在从脑膜炎症状仔猪的脑组织及其他脏器中分离鉴定病原菌。采集患病仔猪脏器分离病原,通过PCR及血清凝集试验鉴定其种属及血清型;透射电镜观察分离株的超微结构;经多序列位点分型分析,鉴定其ST型;通过测定最小抑菌浓度分析其耐药性;经小鼠攻毒试验分析其毒力。结果:最终从患脑膜炎仔猪的脑组织中分离到一株猪链球菌,血清型为9型,将其命名为WH1609。电镜结果显示WH1609有荚膜结构。多位点序列分型结果表明WH1609属于一个新的ST型。耐药性试验结果表明WH1609对多种抗生素耐药;对万古霉素、青霉素及氨苄西林敏感。BALB/c小鼠毒力试验测得LD50为1.89×10~2 CFU·mL-1,病理组织学观察结果显示WH1609感染小鼠可出现明显的脑组织病变。本研究从患脑膜炎的仔猪脑组织中分离到一株猪链球菌9型强毒株,其在BALB/c小鼠的半数致死量为已发现的猪链球菌强毒株的10~5倍以上,对猪链球菌致脑膜炎分子机制的研究有重要的意义。 相似文献