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1.
牛卵母细胞减数分裂期组蛋白H4K12乙酰化的变化 总被引：2，自引：0，他引：2
试验以牛卵母细胞作为材料,以曲古抑菌素A作为去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。应用激光共聚焦显微镜技术,通过检测卵母细胞组蛋白H4K12乙酰强度,探讨乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期的活性。TSA的处理浓度为80μmol/L。结果显示,组蛋白H4K12乙酰荧光强度在卵母细胞减数分裂期完全消失;在TSA存在下培养成熟的卵母细胞,在减数分裂期检测到强的组蛋白H4K12乙酰化荧光强度;然后卵母细胞移入不含TSA的培养液中,3h后组蛋白H4K12乙酰荧光强度再次完全消失。结论:HAT在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期无活性,HDAC在减数分裂Ⅰ、Ⅱ期有活性。 相似文献
2.
旨在克隆牦牛组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)基因,并检测其在牦牛不同组织及卵母细胞减数分裂过程中的表达水平,从而为研究HDAC1在牦牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。本试验采用牦牛为研究对象,通过RT-PCR技术获得牦牛HDAC1基因CDS序列,使用相关生物信息学软件分析其结构和功能,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测HDAC1基因在牦牛脑、心、肌肉、卵巢、肾、脾、小肠、肝、肺和子宫组织中的表达谱及在卵母细胞减数分裂过程中mRNA的表达水平。结果表明,HDAC1基因开放阅读框为1 302 bp,编码433个氨基酸,与黄牛、山羊和绵羊的同源性较高;HDAC1基因在牦牛的各个组织中均有表达,其中在脾、肾和小肠中的表达量极显著高于其他组织(P0.01)。在牦牛减数第一次分裂中期(MⅠ)和减数第二次分裂中期(MⅡ)卵母细胞中,HDAC1基因的表达水平极显著高于生发泡(germinal vesicle,GV)期(P0.01)。提示,HDAC1基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程。本试验为进一步研究HDAC1基因在高寒、低氧环境下的牦牛生殖繁育中的作用提供了理论依据。 相似文献
3.
建立有效的脂质体瞬时转染法,将小干扰RNA(siRNA)转染至小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),从而抑制其乙酰化组蛋白酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)的表达。使用阳离子脂质体法瞬时转染小鼠肾小管上皮细胞,用荧光标记siRNA(FAM-siRNA)筛选转染比例,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)确定最优条件并检测不同位点(374,525和822)HDAC1-siRNA的抑制效果,噻唑蓝(MTT)法检测不同时间点HDAC1-siRNA对RTECs增殖的影响,并设立曲古霉素处置组作为试验对照。荧光表达和Real-time PCR结果显示30 pmol siRNA∶1.5 μL LipofectamineTM 2000为最佳转染条件,HDAC1-374的干扰效果最明显。MTT检测结果显示,HDAC1-374与TSA一致,证实HDAC1-siRNA能有效抑制RTECs的增殖。本试验利用脂质体瞬时转染siRNA法成功抑制了RTECs中HDAC1的表达。 相似文献
4.
为研究卵母细胞成熟过程中组蛋白H3第10位丝氨酸(H3Ser10)磷酸化变化规律及其表达水平,本研究以体外成熟免卵母细胞为材料,采用免疫荧光标记方法检测兔卵母细胞成熟各时期组蛋白H3Ser10磷酸化的动态分布,同时探讨不同浓度组蛋白磷酸化激酶抑制剂(ZM447439)处理卵母细胞对组蛋白H3Ser10磷酸化表达的影响.结果显示:(1)兔卵母细胞组蛋白H3Ser10磷酸化始于生发泡破裂期(GVBD),且表达水平最高；第1次减数分裂中期(MⅠ期)磷酸化水平降低,第1次减数分裂后期(AⅠ期)及第2次减数分裂中期(MⅡ期)磷酸化水平呈上升趋势,但均比GVBD期低.(2)低浓度ZM447439对兔卵母细胞核成熟进程影响不大,当其浓度增加到30 μmol/L时,93.5％的卵母细胞停留在GVBD期.(3)ZM447439浓度为5μmol/L时,20.7％卵母细胞H3Ser10去磷酸化,其他卵母细胞H3Ser10磷酸化信号与未处理组相似；当ZM447439浓度增加到30μmol/L时,大多数卵母细胞中的H3Ser10磷酸化消失.以上结果表明:兔卵母细胞组蛋白H3Ser10磷酸化始于GVBD期,且一直持续到MⅡ期,GVBD期磷酸化水平最高.ZM447439可有效抑制兔卵母细胞减数分裂的恢复,且随其浓度的增加,组蛋白H3Ser10磷酸化水平降低；当浓度达30μmol/L时,卵母细胞组蛋白H3Ser10终止磷酸化. 相似文献
5.
旨在探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)复制的影响，以确定组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)在PPRV复制过程中的作用。采用RT-qPCR法检测PPRV感染后Vero细胞HDACs(HDAC1~11) mRNA表达水平的变化；用针对不同类型HDACs的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞48 h，Western blot筛选影响PRPV N蛋白表达的抑制剂；应用筛选出的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞，通过RT-qPCR、Western blot和TCID50法进一步分析抑制剂对病毒RNA、蛋白和病毒滴度的影响。结果显示，PPRV感染后，Vero细胞HDAC2 mRNA水平显著升高(P<0.05)；SAHA、TMP269、MGCD0103处理后，PPRV N蛋白的表达量明显降低，且呈剂量负相关；SAHA、TMP269、MGCD0103也显著降低PPRV N RNA表达水平(P<0.05，P<0.05，P<0.01)和病毒滴度(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。这表明Ⅱa类HDACs抑制剂和Ⅰ类HDACs抑制剂能抑制PPRV的复制，Ⅰ类HDACs (HDAC1~3)和Ⅱa类HDACs (HDAC4~5、HDAC7、HDAC9)可能参与调控PPRV的感染。 相似文献
6.
为探索组蛋白去乙酰化酶9(Histone Deacetylase 9,HDAC9)基因的功能，明确其在芦花鸡不同组织中的表达差异，实验采集芦花鸡各组织，克隆获得HDAC9基因完整CDS区，进行生物信息学分析及组织表达分析。结果显示，芦花鸡HDAC9基因CDS区长度为3 210 bp，编码1 069个氨基酸；芦花鸡HDAC9基因氨基酸序列与號鹦鹉、绿头鸭及雉鸡位于一个分支，同源性较高，亲缘关系较近。HDAC9蛋白分子质量约为118.0 ku，分子式为C5145H8261N1499O1613S33，理论等电点为6.33，半衰期为30 h,HDAC9蛋白为水溶性蛋白；HDAC9蛋白存在信号肽，为分泌蛋白；共存在67个潜在的磷酸化位点；存在3个N-糖基化潜在位点。HDAC9蛋白二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成，三级结构预测结果与其一致。实时荧光定量PCR结果显示，HDAC9基因在芦花鸡不同组织中表达水平存在显著差异，其中在胸肌中表达量最高，其次为睾丸。本实验结果为... 相似文献
7.
《中国兽医学报》2015,(9):1472-1475
小分子化合物-丙戊酸(valproic acid,VPA)作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACIs),能够有效促进体细胞重编程的效率。为了探讨VPA对microRNA和多能性转录因子的影响,首先用MTT法确定VPA的浓度梯度,采用流式细胞术检测VPA对3T3细胞周期的阻滞情况,同时观察细胞形态的变化,并用荧光定量PCR法检测Oct4和Sox2以及miR-367表达量的变化。结果显示,VPA剂量依赖性地抑制3T3细胞的增殖,且随着浓度的升高抑制作用增强,并将细胞周期阻滞在G2/M期。此外,VPA能使Oct4和miR-367的表达量增加。这表明VPA在体细胞重编程中可能介导多能性转录因子Oct4和miR-367的表达来促进重编程效率。 相似文献
8.
KDM2B基因克隆及其在牦牛组织和卵母细胞减数分裂过程中的表达研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在克隆牦牛组蛋白去甲基化酶2B(Lysine-specific histone demethylase 2B,KDM2B)基因,检测其在牦牛不同组织及其在卵母细胞减数分裂过程中的表达水平,从而为研究KDM2B基因在牦牛减数分裂中的作用机制提供试验依据。牦牛屠宰后,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、胃、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织样品,分别提取各个样本的总RNA。另选择3~5周岁的健康牦牛,采集卵巢后,抽取卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs),透明质酸酶作用后,获得卵母细胞和颗粒细胞,利用RT-PCR扩增得到KDM2B基因CDS区序列,实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测KDM2B基因在不同组织中的表达水平。体外培养获得GV、MI、MII 3个时期COCs,用qRT-PCR法检测KDM2B基因在卵母细胞减数分裂过程中的表达规律。结果表明,KDM2B基因CDS区长为3 930bp,编码1 309个氨基酸,与牦牛已有预测序列相比,属于长型转录本。与牛、绵羊、山羊的同源性较高,与斑马鱼和鸡的同源性较低。KDM2B基因在牦牛的各个组织中均有表达,其中脾、子宫、睾丸和卵巢的表达量较高。在MI期卵母细胞中,KDM2B基因的表达水平显著高于GV期和MII期(P0.01)。在卵丘颗粒细胞中,KDM2B基因的表达水平随减数分裂的进行而显著增加(P0.01)。本研究为进一步研究牦牛卵母细胞减数分裂机制及改善牦牛繁殖效率提供基础资料。 相似文献
9.
《中国畜牧杂志》2021,(8)
实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据。利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平。结果表明:随着水牛年龄增长,原代成纤维细胞扩展速度不断下降,P2代细胞的生长曲线呈典型的S型,3月龄胎儿水牛成纤维细胞的增殖能力均高于新生水牛和10岁龄水牛(P0.05);3月龄胎儿水牛与新生水牛的DNA甲基化水平低于10岁龄水牛(P0.01),3月龄胎儿水牛成纤维细胞的DNA甲基化转移酶基因DNMT1、DNMT3A低于新生水牛和10岁龄水牛(P0.01);随着年龄增长,水牛成纤维细胞组蛋白乙酰化转移酶HAT1基因的表达降低(P0.01),组蛋白去乙酰化酶HDAC1基因的表达升高(P0.01)。以上结果说明,水牛胎儿成纤维细胞处于低DNA甲基化高组蛋白乙酰化状态,可能更适合作为供体细胞用于水牛体细胞克隆研究。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(1):163-170
旨在探讨Scriptaid和5-Aza-CdR共同处理水牛耳部成纤维细胞(buffalo adult fibroblasts,AFs)对细胞生长特性、DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响,为提高水牛体细胞重编程效率提供一定的理论基础。首先使用不同浓度的Scriptaid(0,0.05,0.10μmol/L)和5-Aza-CdR(0,0.02,0.10μmol/L)分别处理AFs,筛选出最佳处理浓度后联合处理AFs 24h。随后采用免疫荧光染色技术分析联合处理后细胞的DNA甲基化和组蛋白H3K18乙酰化变化情况,并使用实时荧光定量PCR(QPCR)技术对其甲基化和乙酰化相关基因的表达进行检测。结果发现,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)对细胞正常的形态、生长无显著影响。与对照组相比,联合处理后AFs中DNA甲基化水平显著降低,而组蛋白H3K18位点的乙酰化水平显著上升(P0.05)。QPCR分析结果显示,联合处理后AFs中的DNA甲基化相关基因Dnmt1、TET1和TET2的表达水平均出现下调,其中Dnmt1的表达水平显著低于对照组(P0.05);组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的表达水平也出现下调,其中HDAC1下调显著(P0.05);而组蛋白乙酰化转移酶CBP,P300和HAT1的表达水平出现上升,其中P300和HAT1的表达水平显著高于对照组(P0.05)。结果表明,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)联合处理AFs,对细胞形态和生长无显著影响,但可以有效降低细胞甲基化水平并提高组蛋白H3K18位点的乙酰化水平。 相似文献
11.
致仔猪脑膜炎猪链球菌的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在从脑膜炎症状仔猪的脑组织及其他脏器中分离鉴定病原菌。采集患病仔猪脏器分离病原,通过PCR及血清凝集试验鉴定其种属及血清型;透射电镜观察分离株的超微结构;经多序列位点分型分析,鉴定其ST型;通过测定最小抑菌浓度分析其耐药性;经小鼠攻毒试验分析其毒力。结果:最终从患脑膜炎仔猪的脑组织中分离到一株猪链球菌,血清型为9型,将其命名为WH1609。电镜结果显示WH1609有荚膜结构。多位点序列分型结果表明WH1609属于一个新的ST型。耐药性试验结果表明WH1609对多种抗生素耐药;对万古霉素、青霉素及氨苄西林敏感。BALB/c小鼠毒力试验测得LD50为1.89×10~2 CFU·mL-1,病理组织学观察结果显示WH1609感染小鼠可出现明显的脑组织病变。本研究从患脑膜炎的仔猪脑组织中分离到一株猪链球菌9型强毒株,其在BALB/c小鼠的半数致死量为已发现的猪链球菌强毒株的10~5倍以上,对猪链球菌致脑膜炎分子机制的研究有重要的意义。 相似文献
12.
本研究开展了两项试验,评估小麦-大麦和玉米浸泡后或干日粮添加植酸酶对植酸含量和磷表观消化率的影响。在试验1中,小麦和大麦以1:1混合或小麦-大麦-玉米以1:1:2混合后浸泡0、2、4、8和24 h,其中小麦-大麦-玉米混合日粮中添加1250 FTU/kg植酸酶。结果显示,日粮类型与浸泡时间对植酸盐含量的影响具有显著交互作用(P <0.05),植酸盐含量随浸泡时间的延长而降低,其中小麦-大麦-玉米混合日粮+植酸酶下降幅度最大,其次为小麦-大麦-玉米混合日粮、小麦-大麦日粮和玉米日粮,植酸降解K值分别为8.7、15.8、24.4和303.4 h。小麦-大麦日粮或玉米日粮浸泡2、4、8和24 h后,植酸盐含量的估计值提高0.17、0.34、0.42和0.5 g/kg,显示出非加性效应。在小麦-大麦-玉米日粮浸泡2、4、8和24 h时,较单独浸泡的玉米植酸盐的降解高0.15、0.30、0.42和0.49 g/kg。试验2选择24头仔猪,每窝均重为(47±2)kg,猪被关在代谢笼中,饲喂试验1中的4种日粮,为期12 d(5 d预饲期,7 d样品收集期)。小麦-大麦-玉米混合日粮+植酸酶组磷表观消化率表现为最高,其次是小麦-大麦日粮组、小麦-大麦-玉米日粮组和玉米日粮组(P <0.05)。玉米日粮中磷表观消化率较小麦-大麦混合日粮低27%(P <0.05)。小麦-大麦-玉米混合日粮+植酸酶较小麦-大麦-玉米混合日粮磷表观消化率显著提高13%(P <0.05)。小麦-大麦-玉米日粮+植酸酶组磷表观消化率较玉米日粮提高14.6%。综上所述,小麦和大麦中存在的植酸酶是非特异性的,其与玉米以1:1:2混合浸泡后可以降解植酸磷。因此,小麦-大麦-玉米混合日粮浸泡后对植酸的降解水平不具有加性效应。用混合日粮饲喂猪,磷表观消化率也无加性效应。因此,在制定猪日粮配方时需要考虑磷消化率值非加性,以保证磷的有效利用。 相似文献
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日粮脱脂米糠替代玉米水平对苏淮猪生长性能、肠道发育及养分消化率的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在研究日粮脱脂米糠替代玉米水平对苏淮育肥猪生长性能、肠道发育及养分表观消化率的影响,筛选苏淮猪最适宜的脱脂米糠替代玉米水平。本试验选择体重相近(62.90±0.78)kg、健康的苏淮阉公猪35头,随机分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组5个处理组。每组7个重复,每个重复1头猪。试验预饲期10 d,所有猪自由采食对照组基础日粮;正试期28 d,对照组饲喂基础日粮,试验Ⅰ～Ⅳ组分别饲喂以7%、14%、21%、28%的脱脂米糠替代等量玉米的日粮。5组日粮的中性洗涤纤维(NDF)水平分别为8.89%、11.80%、12.93%、14.35%、17.94%。正式期所有猪均自由采食和饮水。试验期每天纪录所有试验猪的采食量和体重;分别于试验期第0、14天采集粪样,试验第28天采集直肠内容物,用于测定养分表观消化率;试验结束屠宰全部试验猪,测量计算胃肠道相对质量和相对长度。结果表明:1)各处理组间猪的初始体重、第14天体重、终末体重、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、第0～14天平均日增重、第14～28天平均日增重、料重比(F/G)均无显著差异(P>0.05)。但对照组、试验Ⅰ～Ⅳ组的第14～28天平均日增重显著高于第0～14天平均日增重(P<0.05)。生长拟合曲线显示,各组猪生长曲线拐点分别是第18.51天(75.87 kg)、第15.92天(73.61 kg)、第17.39天(75.91 kg)、第17.58天(75.45 kg)、第16.29天(76.15 kg)。与对照组相比,试验组猪较早到达生长曲线拐点。但各组生长趋势差异不明显。2)饲喂不同纤维水平的日粮对各组猪胃肠道相对重量、长度及大肠的重量、长度占比均无显著影响(P>0.05)。3)试验期第14、28天,随着日粮纤维水平的升高,各组NDF表观消化率与对照组无显著差异(P>0.05),酸性洗涤纤维(ADF)和粗蛋白(CP)表观消化率均呈线性(P<0.01)、二次方(P<0.01)和三次方(P<0.01)降低;试验期第14天,粗脂肪(EE)表观消化率趋于二次方降低(P<0.10)。4)根据三次方程模型预测,分别以ADF、CP表观消化率为因变量,得到适宜脱脂米糠替代部分玉米水平分别为12.77%、14.78%。在各组日粮消化能和粗蛋白均满足且一致的情况下,增加日粮纤维水平对苏淮育肥猪生长性能、肠道发育、NDF表观消化率没有显著影响,但降低了对ADF和CP的表观消化率。本试验的脱脂米糠替代部分玉米是可行的,替代比例以12.77%最佳。 相似文献
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外源腐胺与亚精胺提高假俭草低温胁迫耐受性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为明确外源多胺对低温胁迫下假俭草体内的抗氧化酶活性及渗透调节物质含量的调节作用,以及对假俭草耐寒性的影响,本文测定分析了外源多胺处理对低温胁迫下假俭草叶片组织的相对电导率、丙二醛含量、抗氧化酶活性以及渗透调节物质含量的影响。研究结果表明：喷施0.1mM浓度的外源腐胺与亚精胺显著降低假俭草在低温胁迫过程中叶片组织的相对电导率与丙二醛含量,并显著提高了超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶与过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,以及可溶性多糖、脯氨酸、腐胺、亚精胺与精胺等渗透调节物质的含量。研究结果证实了外源多胺处理可以通过提高假俭草叶片组织抗氧化酶的活性和渗透调节物质的含量,减轻组织在低温胁迫下的伤害程度,这为草坪养护过程中使用外源多胺物质提高假俭草耐寒性提供了依据。 相似文献
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本试验旨在研究肉种鸡饲粮中添加不同水平肌苷酸(IMP)对生长后期(22~42日龄)子代生长性能和血清生化指标的影响。试验选取遗传背景相同、体重相近的20周龄健康爱拔益加(Arbor Acres)肉种鸡480只,随机分为4组,Ⅰ组(基础日粮)、Ⅱ组(基础日粮+0.2%肌苷酸)、Ⅲ组(基础日粮+0.5%肌苷酸)和Ⅳ组(基础日粮+1%肌苷酸)。子代肉鸡根据肉种鸡饲粮中肌苷酸添加情况相应分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组,每组6个重复,每个重复80只,子代肉鸡仅饲喂基础日粮,试验期为子代肉鸡22~42日龄。结果显示:与Ⅰ组相比,22~42日龄子代肉鸡各组生长性能无显著差异(P>0.05);在子代肉鸡42日龄时,与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅳ组子代肉鸡血清中总蛋白(TP)的含量显著提高(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅲ组、Ⅳ组血清中低密度脂蛋白(LDL-c)含量显著提高(P<0.05);与Ⅰ组相比,Ⅱ组、Ⅳ组血清中甘油三酯(TG)含量显著降低(P<0.05)。以上结果表明,肉种鸡饲粮中添加肌苷酸对子代生长性能无显著影响,但饲粮中添加0.2%肌苷酸可显著提高生长后期子代血清中TP的含量,降低TG的含量,添加0.5%和1%肌苷酸可显著提高生长后期子代血清中LDL-c含量,且添加1%肌苷酸可显著提高TP含量。 相似文献
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产仔数是反映猪场生产水平和经济效应的一个重要的指标,作为多基因控制、遗传力低的复杂经济性状,鉴别影响产仔数的基因位点,利用分子选育标记来提高猪的产仔性能倍受重视。随着重测序成本的不断降低,基因组学研究不断深入,以全基因组重测序、简化基因组测序和基于高通量测序技术获得的芯片技术已得到广泛应用。本文综述了通过高通量测序技术以及基于高通量测序的芯片技术研究影响猪产仔数性能的数量性状座位(quantitative trait loci,QTL)及候选基因的研究进展,为后期鉴别影响产仔数变异主效基因提供参考,为生产采用分子育种进行产仔选育提升提供分子标记信息。 相似文献
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噬菌体作抗生素替代物用于动物生产,已被逐步认可和积极评价。将噬菌体应用于抗菌,主要是应用其裂解作用。为更科学地研发和应用噬菌体,本文综述了应用较普遍的dsDNA噬菌体近年来相关裂解机制的研究。目前发现,绝大多数dsDNA噬菌体均采用"穿孔素-内溶素"裂解系统,其主要由穿孔素和内溶素组成,分别破坏细菌细胞膜和肽聚糖层,致使细菌被裂解;而对革兰阴性菌的裂解,还需膜融合蛋白的参与。此外,还存在一种"针穿孔素-SAR内溶素"裂解系统,其主要由针穿孔素、信号锚定释放内溶素和膜融合蛋白组成,作用机制与上述裂解系统存在明显差异。本文为开发和应用噬菌体及其裂解相关蛋白提供了理论基础。 相似文献
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为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性的引物,以猪肺炎支原体168株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增醛缩酶基因。将FBA克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析,结果表明,FBA基因全长864 bp。将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/FBA转化至大肠埃希菌BL21(DE3),通过筛选获得阳性克隆,重组工程菌在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白猪肺炎支原体Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(Mhp FBA),大小约为35 ku。纯化蛋白并接种于猪气管上皮细胞至FBA终浓度分别为0、10、50、100、150、200μg/mL,孵育24 h后进行上清中丙酮酸浓度的检测和细胞凋亡检测。结果上清中丙酮酸浓度随着FBA浓度的上升,出现先极显著上升(P<0.01)、后急剧下降的现象;细胞平均凋亡率依次分别为3.54%、10.91%、13.99%、27.19%、32.84%和40.71%,并随着FBA浓度的升高而升高,且相比阴性对照组差异均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。成功构建了Mhp FBA重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白FBA,该蛋白可能为猪肺炎支原体的毒力因子,参与猪肺炎支原体的致病作用,从而为进一步开展Mhp致病机理和药物研究奠定基础。 相似文献