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1.
《畜牧与兽医》2021,(6)
为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl; Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。 相似文献
2.
为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白的原核表达产物均与M1多抗反应,均不与2株M1单抗反应;拯救的两种重组病毒感染细胞后及其M1蛋白的真核表达产物均与M1的单抗5F2反应,不与单抗3G8及M1的多抗反应,两种亚型的结果一致;而两种亚型的M2蛋白通过与单抗和多抗反应,出现了不一致的结果,M2的单抗仅与蝙蝠流感病毒M2的原核表达产物反应,不与H9N2禽流感病毒M2的原核表达产物反应,M2的多抗则反之;且M2的多抗仅与H9N2禽流感M2的真核表达产物以及拯救病毒反应,均不与蝙蝠流感病毒M2的真核表达产物及拯救病毒反应。本研究证实这两种亚型流感病毒的M2蛋白之间确实存在免疫原性的差异,并且筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2016,(4):579-584
克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。 相似文献
4.
为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋... 相似文献
5.
CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在调控信号传导等方面发挥重要作用。采用PCR扩增CBL基因片段并连接到pEGFP-C1载体中,经Bam HⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及基因测序,成功构建真核表达重组载体pEGFP-CBL。倒置荧光显微镜观察和Western blot结果证实,重组载体pEGFP-CBL在BHK-21细胞中成功表达。病毒增殖试验结果证实,日本脑炎病毒(JEV)强毒株感染转染pEGFP-CBL重组载体的BHK-21细胞,3 d内未见明显细胞病变。结果表明,真核表达载体pEGFP-CBL成功构建,且重组表达的CBL蛋白能够抑制早期JEV增殖,从而为深入研究CBL蛋白的免疫调节功能奠定了基础。 相似文献
6.
为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用，我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A／Duck／Guangdong／40／2000（H5NI）（简称DKGD／40／00）和A／Duck／Guangxi／35／2001（H5NI）（简称DKGX／35／01）的NSI基因克隆到真核表达载体plRES2-EGFP，转染Hela细胞后，应用荧光显微镜检测转染表达效率，应用TUNEL和流式细胞仪观察NSI基因产生的细胞凋亡作用。结果两株病毒NSI蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡，凋亡率无明显差异。表明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。 相似文献
7.
《中国动物传染病学报》2016,(4)
动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一,本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明,构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后,同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白;转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到2~4血凝价;通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒,为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。 相似文献
8.
本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞：3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。 相似文献
9.
《甘肃畜牧兽医》2021,51(9)
目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
10.
《中国动物传染病学报》2019,(1)
目前,我国现有的商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗的免疫效果及其安全性优于灭活苗,成为近年研究的热点。本研究旨在建立一种H9N2亚型流感病毒VLP疫苗制备的方法。将优化的H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因和未优化的HA、NA基因分别插入到pFastBack~(TM)Dual载体中,得到相应的重组供体。然后将这些重组供体转化至含Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,获得含有目的基因的重组杆粒。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,红细胞凝集试验、SDS-PAGE和Western blot结果显示,优化的HA、NA基因编码的蛋白在Sf9昆虫细胞中获得了成功表达。通过透射电子显微镜观察细胞上清的浓缩液,能检测到VLP。结果表明,本研究在Sf9昆虫表达系统中成功表达了H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白,并形成了VLP,为进一步研究该病毒VLP疫苗奠定了基础。 相似文献
11.
12.
为了解2017年冬季上海临床接诊犬的流感病毒感染情况和病毒变异趋势,收集上海某动物医院疑似犬流感样品进行RT-PCR检测,构建HA、NA的重组载体并测序,对获得的序列进行进化分析、氨基酸变异分析,综合我国同亚型犬流感病毒HA序列进行进化率分析。结果显示:23份疑似样品中检出5份阳性样品,获得5个H3亚型的HA序列、2个N2亚型的NA序列,上述序列在进化树中已经形成独立的进化分支,与韩国、广东毒株亲缘关系最近;氨基酸比对表明,HA和NA在重要位点发生许多一致的突变,如抗原位点区域、糖基化位点等,NA茎部未见氨基酸插入;对2007年至2017年中国南方地区分离的H3N2犬流感病毒HA片段进行进化率、变异率分析显示,年平均进化率呈逐年增高趋势,变异不断积累。研究表明,开展犬流感病毒变异监测,掌握病毒变异和进化方向,对防控该病、防止病毒向人群传播有重要意义。 相似文献
13.
旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。 相似文献
14.
旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。 相似文献
15.
16.
探讨了肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)两条轴对大鼠非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝脏损伤的相互负向调节作用。30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和用药组。除正常对照组外,其余2组饲喂高脂饲料,用药组另外给伐他汀50 mg/kg·d。3周后,宰杀大鼠,测定血清中甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量;测定肝组织匀浆羟自由基(·OH)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)酶活性;ELISA法测定组织匀浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素1-7(Ang1-7)及白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;Western blot分析肝组织血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管紧张素Ⅱ受体1亚型(AT1R)、Mas受体(MasR)蛋白水平。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠血清TG、AST和ALT含量以及·OH和NOS活性均显著升高(P<0.05), T-AOC、SOD活性显著降低(P<0.05);IL-1β和TNF-α含量极显著升高(P<0.01);ACE、ACE2的蛋白表达水平与ACE/ACE2的比值均显著升高(P<0.05),AngⅡ、Ang1-7含量与AT1R表达升高(P<0.05),MasR表达有升高趋势(P>0.05)。结论:高脂饲料连续饲喂3周可诱导大鼠发生NAFLD,肝脏局部RAS两条轴均处于激活状态,ACE介导AngⅡ-AT1R经典轴促进肝损伤,而ACE2介导Ang1-7-MasR轴抵抗肝损伤;ACE2负性调节RAS作用,对大鼠NAFLD时肝脏氧化应激及炎性损伤有一定保护作用。 相似文献
17.
塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从中筛选出最佳扩增引物,通过对引物浓度、退火温度、延长时间、循环次数进行优化,成功建立了SVA的RT-PCR检测方法。用该方法检测SVA、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应,具有良好的特异性。敏感性试验结果显示,病毒检测限可达1TCID50,比国外文献报道的检测方法灵敏性更高。用该方法检测山东省的100份猪组织样品,阳性率为2%。本研究所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,为SVA的快速检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。 相似文献
18.
为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。 相似文献
19.
本试验旨在研究香芹酚/凹凸棒石(CAR/APT)和香芹酚/氧化锌/凹凸棒石(CAR/ZnO/APT)替代抗生素类促生长剂对肉仔鸡生产性能、免疫机能和抗氧化机能的影响。选取1日龄罗斯308肉鸡192只,随机分成3组,每组8个重复,每重复8只,分别饲喂基础饲粮中添加100mg/kg土霉素钙(OTC)、0.1%CAR/APT和0.1%CAR/ZnO/APT的饲粮,基础饲粮不含抗生素类促生长剂。结果表明:与OTC组相比,CAR/APT和CAR/ZnO/APT对肉鸡1~21日龄生产性能无显著影响(P>0.05)。与OTC组21日龄肉鸡相比,CAR/ZnO/APT对胸腺和脾脏器官指数无显著影响(P>0.05),显著降低法氏囊器官指数(P<0.05);CAR/APT对法氏囊指数无显著影响(P>0.05),显著降低胸腺和脾脏器官指数(P<0.05)。与OTC组21日龄肉鸡相比,CAR/ZnO/APT显著提高血清IgG含量(P<0.05),CAR/APT对血清免疫球蛋白含量无显著性影响(P>0.05)。与OTC组21日龄肉鸡相比,CAR/ZnO/APT有提高空肠黏膜sIgA和IgG含量的趋势(P=0.055);CAR/ZnO/APT组空肠黏膜IgM含量显著高于CAR/APT组(P<0.05)。与OTC组21日龄肉鸡相比,CAR/ZnO/APT显著提高血清和空肠黏膜中T-AOC及血清CAT活性(P<0.05);CAR/APT显著提高血清CAT活性和空肠黏膜T-AOC(P<0.05);CAR/ZnO/APT组21日龄肉鸡血清和空肠黏膜T-AOC显著高于CAR/APT组(P<0.05)。结果表明,以0.1%CAR/APT或CAR/ZnO/APT替代饲粮中的OTC,对肉仔鸡生产性能无显著影响,具有提高免疫机能和抗氧化机能的作用,其中CAR/ZnO/APT效果更优。 相似文献
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本研究旨在探究山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞后的转录组基因变化情况,丰富CPIV3转录组信息。取1MOI CPIV3JSHA2014-1病毒液感染MDBK细胞,设非感染正常细胞为对照,于24h后收获细胞,提取总RNA,利用Illumina HiSeqTM2500对感染组与对照组进行高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果显示,差异表达基因共261个,其中表达上调140个,表达下调121个,经RT-qPCR方法验证8个差异表达的干扰素信号通路相关基因,结果与高通量测序一致。进一步GO分类结果显示,差异表达基因主要涉及细胞生物学进程、构成细胞的组分以及实现的分子功能三个方面,KEGG分析显示这些基因参与代谢、生物系统、细胞进程、基因信息进程和环境信息进程。本研究为深入探究CPIV3的致病机制奠定了基础。 相似文献