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1.
为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5 和部分NSP2 基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒。分离的病毒株被鉴定为PRRSV 美洲型,命名为XJ-Q 株。该株病毒与香港分离株HK13 亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1 和JXA1）同源性较为亲近。与美洲型标准毒株VR-2332 相比,该分离株在481 位和532~560 位共有30 个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV 变异株相比,在487~489 位有3 个氨基酸的独特缺失。结果表明,新疆分离株为PRRSV 美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株。 相似文献
2.
为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株(HUB1和JXA1)同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株. 相似文献
3.
根据GenBank中登录的美洲型PRRSV JXA1株基因组序列设计合成了4对引物,应用RT-PCR技术对PRRSV JX0708株结构蛋白基因进行扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行分析,并与国内外分离株进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性比较.结果表明:PRRSV JX0708株结构蛋白基因长约3 186bp,分为ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个基因区;与国内分离的高致病性PRRSV美洲型毒株HuN、GD、JXA1、LN和普通毒株CH-1a以及经典毒株VR-2332和疫苗毒株pMLV的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别为88.0%～100.0%和83.5%～100.0%;而与欧洲型经典毒株LV和Euro-1的同源性差异显著,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为64.0%～69.7%和53.3%～79.9%.遗传进化分析表明,PRRSV JX0708株在基因型上属于美洲型,同时美洲型PRRSV的变异存在某种地域和时间跨度上的相关性,但每个结构蛋白基因的变异并不严格遵从这种规律,而有所差异. 相似文献
4.
将2008年云南某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例的病料处理后,接种Marc-145细胞,并对其进行病毒分离和鉴定,将分离株命名为Yunnan-08株.根据GenBank中PRRSV的基因序列进行设计.合成了针对ORF5和ORF7基因的引物,将RT-PCR扩增目的基因克隆入pGEM-Teasy载体中进行测序,再将测序结果提交给GenBank.应用DNAstar软件包分析,将该毒株的ORF5和ORF7基因序列及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株Lv、美洲型代表株VR2332和中国参考株CH-1a(AY032626)等毒株相应基因序列进行核苷酸比对,并与ATCC-VR2332(U87392)株、Lv(M96262)株等毒株进行氨基酸同源性比较,绘制系统的进化树,确定遗传演化关系.结果表明,该分离株的ORF7与VR2332的ORF7基因同源性为56.9%,与Lv株的ORF7基因同源性为41.7%;该分离株的ORF5与VR2332的ORF5基因同源性为87.1%,与Lv株的ORF5基因同源性为63.8%.表明新分离到的PRRSV Yunnan-08株仍属北美型,但存在很大变异,该分离株的ORF5与中国标准株CH-1a的ORF5基因同源性为93.4%,而ORF7与中国标准株CH-1a的ORF7基因同源性仅为56.6%.同一个毒株不同的开放阅读框架遗传演化的差异如此之大,这在以往未见报道,该病毒的变异为我国对该病的防控设置了障碍,毒株遗传监测显得十分重要. 相似文献
5.
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。 相似文献
6.
采用RT-PCR方法对疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得2个ORF7基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性比较分析。序列分析结果显示,2个ORF7基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和98.4%,其与欧洲型代表毒株LV、美洲型代表毒株VR-2332、高致病性PRRSV变异株(JXA1、HUN4、HEB1、HUB1)及我国早期分离毒株CH-1a的核苷酸同源性分别为65.9%、93.0%～93.3%、97.6%～98.1%、94.6%～94.9%,氨基酸同源性分别为58.1%、93.5%～94.4%、95.2%～96.0%、91.9%～92.7%。遗传进化树分析结果表明,分离的2个ORF7基因与美洲型代表毒株VR-2332亲缘关系较近,属于美洲型,与CH-1a、HB-2(sh)、我国2006年以后分离的10株(JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011)组成同一个亚群。 相似文献
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将2007年1月河南省某猪场送检的疑似高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,出现细胞聚集、固缩、脱落等特异性细胞病变.根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因序列设计并合成针对NSP2、ORF3和ORF5基因的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆入pMD18-T载体进行测序.并与国内外已发表的毒株的序列进行比较.结果表明:分离毒株Henan-1是美洲型PRRSV,而且NSP2基因发生30个AA的不连续缺失;Henan-1的NSP2、ORF3和ORF5基因与JXA1、JX0612、HZ-X、HB-1(sh)、CH-la、HB-2(sh)、SP、ATCC VR-2332、Henan-HN1、Resp PRRS/Repro MLV、PA8、BJ-4等毒株等位基因的核苷酸同源性分别为83.0%～99.0%、88.3%～99.2%、88.6%～99.5%,推导的氨基酸同源性分别为66.7%～97.9%、84.7%～98.8%、87.1%～99.5%;而ORF3和ORF5基因与LV4.2.1等位基因核苷酸同源性分别为64.7%和64.2%,推导的氨基酸同源性分别为56.7%和61.0%.基因系统发育树分析表明:Henan-1与JXA1、JX0612株的亲缘关系很近,与HB-1(sh)亲缘关系较近,与HZ-X、CH-1a、HB-2(sh)、SP、RespPRRS/Repro MLV等毒株处于不同的分支. 相似文献
8.
【目的】研究新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况。【方法】提取PRRSV感染病猪肺脏RNA,通过RT-PCR方法对PRRSV NSP2部分基因和ORF5基因进行扩增、克隆和测序,分析其分子变异特征。【结果】成功克隆到1株PRRSV,命名为XJzx1株,其NSP2基因编码蛋白第472~476位存在5个氨基酸的连续缺失,有别于高致病毒株第482、533~561位30个氨基酸的典型缺失,位于经典毒株HB-2(sh)/2002第471~482位12个氨基酸缺失区域内;XJzx1与HK13株NSP2部分基因核苷酸序列相似性最高,为87.5%,系统进化树分析显示,XJzx1株与我国高致病毒株JXA1、HUN4、SX2009等同属一个分支;XJzx1 ORF5基因与我国经典毒株CH-1a、BJ-4、HK6等同属一个分支,其GP5蛋白不存在氨基酸的缺失或插入,而表现为多位点的突变。【结论】PRRSV XJzx1株具有独特的遗传进化特征,其毒性较经典毒株有所加强,推测为新型变异株。 相似文献
9.
为了探明研究新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NADC30-like病毒株XJTK的遗传变异特征,本试验分离病毒株后对该病毒的Nsp2和ORF5基因进行克隆和测序,其片段大小分别为648 bp和603 bp,其中Nsp2基因存在3处不连续共393个核苷酸的缺失,分别缺失333,57和3个核苷酸,完全符合NADC30-like毒株的基因特征;将病毒株XJTK与已知北美型PRRSV代表株VR2332,高致病性PRRSV国内代表株JXA1、TJ,美国分离株NADC30,及NADC30-like国内代表株HENAN-HEB、CHsx1401进行序列比对表明,XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列与参考株同源率分别为36.4%～90.3%和83.7%～93.0%,进一步遗传进化分析表明,其与PRRSV毒株VR2332、JXA1和TJ株亲缘关系较远,与美国分离株NADC30及国内NADC30-like代表株CHsx1401和HENAN-HEB亲缘关系较近,同属于NADC30-like亚群,但仍属于相对独立的分支。本研究是新疆首次证实猪群中存在NADC30-like PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防制提供参考依据。 相似文献
10.
【目的】了解福建省NADC30-like PRRSV FJLY01株的分子生物学特征和遗传演化规律,为PRRSV的防控提供参考。【方法】对采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,以NADC30PRRSV毒株基因序列为参考设计并合成9对引物,分别对分离株序列进行分段PCR扩增,经克隆测序后进行序列拼接,采用MEGA 6.0软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制其与其他35株毒株的系统遗传进化树。【结果】FJLY01株基因组全长为15 016bp(不包含polyA),包含10个开放阅读框,5′-UTR长190bp,3′-UTR长148bp,Nsp2基因缺失393bp。Nsp2蛋白存在类似PRRSV MN184和NADC30株的131个氨基酸的缺失。核苷酸比对结果表明,FJLY01株与VR-2332、MLV RespPRRS/Repro、CH-1a和BJ-4株核苷酸的同源性为85.2%~86.3%,与JXA1、HuN4等HP-PRRSV株核苷酸的同源性为83.7%~84.1%,与MN184A、MN184B株核苷酸的同源性为87.9%~88.2%,与NADC30株核苷酸的同源性最高,为97.1%。系统进化树分析表明,该毒株属于NADC30-like毒株,与JXA1、VR2332和CH-1a的亲缘关系较远。【结论】福建省存在NADC30-like毒株,应该加强PRRSV的监测。 相似文献
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[目的]通过对PRL基因(催乳素基因)的克隆及生物信息学分析,研究该基因编码的蛋白对禽类就巢性的作用。[方法]利用原鸡PRL基因mRNA序列(NM-205466)与蓝孔雀表达序列标签(EST)数据库进行Blast检索,以及序列拼接和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得了蓝孔雀PRL基因的部分cDNA序列,并对该序列进行了生物信息学分析。[结果]获得的cDNA序列片段长度为927bp,包括完整的开放阅读框690 bp,编码229个氨基酸。系统发育树的构建发现蓝孔雀与原鸡亲缘关系比较近,与鹑次之,与火鸡亲缘关系最远。[结论]该研究结果为研究PRL蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
12.
PCR扩增轮状病毒VP4基因和大肠杆菌LTB基因编码区,将其克隆至pET32a载体上,构建pET32a-VP4-LTB质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),PCR、酶切鉴定后进一步测序,测序结果表明融合基因片段由2637 bp组成,为编码879个氨基酸残基的多肽。经IPTG诱导和SDS-PAGE检测发现表达产物分子量约为118.9 KD,以包涵体的形式存在。融合蛋白经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫小鼠,结果所产生的抗体效价高于单独VP4蛋白的免疫结果但差异不显著(P0.5),但与对照组相比差异显著。表明所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性,为研制牛轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。 相似文献
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应用分子生物学技术构建了LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,并对多种促进基因表达的物质进行了筛选。应用筛选的促进基因表达物质对pcDST基因疫苗的免疫增强效果进行了观察。结果 :构建的LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,肌注后 1天就有表达 ,到第 7天达到高峰。通过对多种促进基因表达的物质进行筛选证明 ,4.5 %斯苯、1 %甘油、2 5 %蔗糖有明显促进基因的表达作用。 4.5 %斯苯、1 %甘油能促进pcDST猪瘟基因疫苗的免疫效果。表明 :4.5 %斯苯、1 %甘油可做为基因疫苗的免疫佐剂使用 相似文献
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王瑞库 《黑龙江八一农垦大学学报》2004,16(2):30-32
基因工程是当前研究热点之一。全息胚基因工程可以解决转基因中的问题。本文阐述了全息胚基因工程的理论基础、技术方案，分析了技术的实质和关键，并对其应用前景进行了描述。 相似文献
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人工雄性不育基因和恢复基因的克隆及构建研究 总被引：20，自引：0，他引：20
本文报道了用于获得人工雄性不育系的质粒pTABNBAR55和用于获得人工恢复系的质粒pTABSBAR23的构建。用PCR的方法从烟草（Nicotiana tabacum cv.Samsun）中扩增了花药绒毡层特异表达TA29基因上游-291～+12共303bp的片段，称作TA29启动子（简写作pTA29）；从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中扩增了一种RNA酶及其特异抑制剂基因barnase和barstar。DNA序列分析表明，pTA29和barstar片段均与已发表的序列完全一致，barnase片段在3′端和已见报道的两种序列都有一个碱基的差异，但由此推断的氨基酸序列是一致的，不影响其在植物中的表达。把TA29启动子分别与barnase和barstar基因连接起来构成两个嵌合基因pTA29-barnase和pTA29-barstar，在这两个嵌合基因的3′端加上了260bp的Nos终止子（Nos.ter）以增强其在植物中的表达。然后将一个2.0kb的完整除草剂抗性标记“bar cassettee”插在含有这两个基因的质粒上，作为转化和制种过程的筛选标记。若将
前者导入欲作杂交制种母本的植物中，可以获得雄性不育系；后者导入欲作父本的植物中，可获得恢复系。 相似文献
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猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆和序列分析及其基因表达 总被引：1，自引：1，他引：0
采取三元杂交猪的外周血,提取单核细胞总RNA,采用RT-PCR克隆猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA(GenBank登录号为DQ108393)。以pcDNA3.1(-)为质粒载体,构建猪GM-CSF基因真核表达质粒pGM-CSF,对克隆片段进行测序,并进行不同物种间同源性的比较。将重组质粒转染COS-7细胞,Western blotting鉴定表达蛋白的特异性。序列分析表明,GM-CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸和大部分信号肽,与用作PCR引物设计的参考序列比较,其核苷酸的同源性为97.5%,氨基酸的同源性为95.1%,同绵羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比较,其核苷酸的同源性分别为86.2%、80.5%、81.7%、69.7%和81.8%,氨基酸的同源性分别为78.5%、71.3%、70.3%、55.9%和71.5%。Western blotting证实目的基因可以在真核细胞中特异性的表达GM-CSF蛋白。以上结果表明,猪的GM-CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用GM-CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。 相似文献
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从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。 相似文献
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谷胱甘肽还原酶基因的表达载体构建及对马铃薯的转化 总被引：3，自引：0，他引：3
利用 ｐＧＲ２０２和 ｐＢｉｎ１９两种质粒经过 ｐＢＩ ２２２的改建，含有 ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 Ｎｏｓ终止子的 ＣＮ区ＤＮＡ片段与 ｐＢｉｎ１９的 Ｂｉｎ区 ＤＮＡ片段的不对称连接和目的基因 ＧＲ的 ｃＤＮＡ重组于真核表达双元载体三步亚克隆，筛选出一正向插入的谷胱甘肽还原酶基因的真核表达双元载体质粒ｐＢｉｎ－ＣＮ－ＧＲ。再利用此质粒转化的农杆菌ＬＢＡ４４０４进行马铃薯的遗传转化．并分化出卡那霉素抗性苗。过氧化物同工酶和酯酶同工酶谱带显示转化材料与对照之间存在显著的差异．表明转化材料的基因表达发生了变化。对转化影响因素的研究发现培养基的组成成分、选择压（Ｋｍ）添加浓度及加入时机是影响转化率的重要因素。 相似文献
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【目的】分离紫花苜蓿（Medicago sativa L.）油菜素内酯（brassionsterinds,BRs）合成酶基因MsDWF4,分析基因表达特性,开展基因的耐盐性研究,为揭示MsDWF4对紫花苜蓿非生物胁迫的调控机制提供参考。【方法】根据已知的拟南芥DWF4序列,应用同源克隆技术获得紫花苜蓿MsDWF4,对序列进行生物信息学分析。利用qRT-PCR技术分析MsDWF4的组织表达特异性,及其在多种非生物胁迫（高温、冷害、干旱和高盐）和激素（生长素、油菜素内酯、脱落酸和茉莉酸）处理下的表达模式;构建MsDWF4超表达载体,利用农杆菌介导遗传转化法转化紫花苜蓿,获得超表达MsDWF4的紫花苜蓿株系,用高盐（200 mmol·L -1 NaCl）处理紫花苜蓿转基因株系并结合抗氧化酶活性分析,研究MsDWF4是否提高紫花苜蓿的耐盐性。【结果】获得MsDWF4的cDNA序列,其CDS全长1 470 bp,编码489个氨基酸,该基因编码的蛋白质为P450超家族成员,共含有67个激酶磷酸化位点。序列分析和系统发育树分析表明紫花苜蓿MsDWF4与蒺藜苜蓿DWF4的亲缘关系最近,与禾本科的亲缘关系最远。组织特异性表达分析表明,MsDWF4在根尖中表达量最高,花和叶中次之。高温、冷、PEG、NaCl、ABA和IAA均诱导该基因在植株地上部和根部的表达;在BR处理下,MsDWF4在地上部下调表达,而在根部先被诱导后被抑制;JA处理下,MsDWF4在地上部和根中皆被抑制。构建35S∷MsDWF4超表达载体,并通过农杆菌介导的方式转化紫花苜蓿,PCR鉴定结果显示MsDWF4已经成功转入紫花苜蓿,并获得6个转基因阳性株系。盐胁迫处理下,转基因株系MsDWF4的表达量和抗氧化酶活性均显著高于对照。【结论】获得紫花苜蓿油菜素内酯合成酶基因MsDWF4的CDS序列;该基因在根尖等生长旺盛部位表达最高,基因表达响应多种逆境胁迫和外源激素处理;MsDWF4提高转基因紫花苜蓿对盐胁迫的抗性。MsDWF4可能参与转基因紫花苜蓿的多种逆境响应过程,并且正向调控紫花苜蓿的耐盐性。 相似文献