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1.
采用RT—PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因，将扩增产物与pGEM—Teasy载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体，经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE、Western—blotting；用所表达的蛋白免疫小鼠，经ELISA检测血清抗体，验证其免疫原性。结果显示，所克隆的T24基因片段长716bp，含有1个678bp的开放阅读框，其编码226个氨基酸，与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％；表达的融合蛋白大小为40ku，并能被猪囊虫阳性血清识别；免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体，第30d达到较高水平，表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。 相似文献
2.
樱桃谷鸭白介素18基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从鸡新城疫病毒刺激的鸭脾脏淋巴细胞培养液中提取基因组RNA，采用RT—PCR方法扩增鸭IL-18基因，插入pMD18-T载体，进行序列测定与分析。将成熟鸭IL-18基因亚克隆到表达载体PBCX中，并转化入大肠杆菌E．coliBL21进行表达。测序结果表明，该基因由603个核苷酸组成，包含一个完整阅读框，共编码201个氨基酸。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量约为59KD的融合蛋白。 相似文献
3.
猪雌激素受体α基因E区部分cDNA克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：1
采用逆转录PCR（RT-PCR）法从梅山猪子宫组织中扩增雌激素受体α（ERα）基因E区部分cDNA编码区546bp，并将其重组于谷胱甘肽转移酶（GST）融合表达质粒pGEX-6p-1中，经酶切、序列鉴定分析后，用该重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙基B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生GST-ERαE融合蛋白，分子量约为49ku，净灰度扫描融合蛋白占重组菌蛋白32％，结果表明成功构建GST—ERαE融合蛋白表达载体，并获得高效表达，为下阶段深入开展ERα蛋白功能研究打下了良好的基础。 相似文献
4.
本研究旨在获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素基因编码区序列,揭示其原核表达规律.采用RTPCR方法从版纳微型猪近交系(BMI)脑垂体中克隆生长激素(GH)基因,并将其连接到pMD 18-T载体进行测序和生物信息学分析.克隆得到的GH基因cDNA序列长690 bp,其中CDS长651 bp,编码216个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽序列.多猪种GH氨基酸序列比对表明其在各猪种中高度保守,版纳微型猪近交系的GH氨基酸序列与五指山猪和宁香猪的相似性均为100％,与藏猪、香猪、大乌猪、太湖猪、成华猪、内江猪、荣昌猪、长白猪、约克夏的相似性均为99％,与雅南猪、杜洛克的相似性均为98％.扩增GH成熟肽区编码序列,定向克隆至表达载体pET-32a(+),转化入大肠杆菌Rosseta (DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达蛋白.SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为40.6 ku.以上结果为进一步探究GH基因对BMI矮小性状的影响奠定了基础. 相似文献
5.
猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。 相似文献
6.
以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。 相似文献
7.
为研究胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)基因的遗传分化,探索其结构和功能,根据鸡、人、小鼠、牛等动物BLVRA基因编码区的保守序列设计一对引物,以缙云麻鸭输卵管子宫部的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出鸭BLVRA基因的一段cDNA编码序列,并对其进行测序及序列分析。结果表明:该cDNA序列由634个核苷酸组成,编码211个氨基酸,分子量为24.1ku。与鸡、小鼠、牛、蟾蜍和人的核苷酸相似性分别为92.6%、64.9%、62.8%、69.0%、63.6%;氨基酸的相似性分别为96.2%、59.7%、60.7%、68.4%、59.7%,说明BLVRA基因在进化过程中较为保守。进一步的系统进化分析表明,鸭BLVRA基因与鸡的进化关系最近,蟾蜍次之,小鼠、牛和人较远,与传统的分类地位基本吻合。该基因部分cDNA序列的克隆,为获得BLVRA基因全长及其在各组织中的表达研究奠定了基础。 相似文献
8.
参照GenBank上牛和猪的Klf4 cDNA序列设计特异引物,采用RT-PCR方法从怀孕60d的胎绵羊皮肤总RNA中扩增绵羊Klf4基因编码区序列,利用生物学软件对其进行序列分析;将该编码区连接到原核表达载体pET-30b(+)上并转化BL21大肠杆菌,在IPTG诱导下进行表达。经测序,绵羊Klf4基因编码区序列包括终止密码子在内的1 434bp,编码477个氨基酸,已在GenBank上登录(登录号GQ280389),与牛、猪、马、人、猕猴、黑猩猩、鼠等物种相比,绵羊Klf4基因CDS区的核苷酸序列相应序列同源性分别为98.26%、93.81%、93.24%、90.24%、90.13%、90.37%和87.25%,其氨基酸序列同源性分别为99.58%、97.94%、96.02%、94.14%、93.51%、92.08%和92.66%;生物软件分析显示,绵羊Klf 4含有细胞核定位模体和锌指结构域。利用克隆获得的绵羊Klf4 cDNA所构建的表达载体pET-30-Klf4,经IPTG诱导在BL21大肠杆菌中成功表达相对分子质量约为57 000的融合蛋白His-Klf4。 相似文献
9.
为了克隆五指山小型猪程序性死亡因子10(PDCD10)cDNA基因并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法,克隆得到PDCD10全长cDNA序列,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:经比对分析发现,五指山小型猪PDCD10基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、牛、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼、黑腹果蝇等具有较高的相似性。生物信息学分析结果表明,该cDNA序列全长1 250 bp,在序列3’末端有终止信号AATAAA。含636 bp(184～819 nt)的开放阅读框,编码212个氨基酸。该蛋白理论等电点(PI)及分子质量分别为7.80和24 701.57 u。 相似文献
10.
根据GenBank中公布的山羊Leptin基因部分基因组核苷酸序列，设计合成一对引物，以山羊脂肪组织总RNA为模板，采用RT—PCR法，扩增出Leptin成熟蛋白编码cDNA序列，将此扩增产物克隆入pMD18-T载体，进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明，扩增的山羊Leptin基因编码序列长为441bp，编码146个氨基酸。同源性分析表明，山羊Leptin基因成熟蛋白编码cDNA与小鼠、人、猪、牛及绵羊基因相应序列的同源性分别为82．22％、87．76％、92．97％、96．15％和98．64％，氨基酸同源性为84．25％、86．99％、92．47％、97．95％和100．00％，说明Leptin是一组在进化上高度保守的蛋白质。山羊Leptin成熟蛋白cDNA的成功克隆，为进一步研究黄淮山羊Leptin基因全结构、基因表达与调控奠定了基础。 相似文献
11.
根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
12.
为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。 相似文献
13.
将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。 相似文献
14.
In order to construct the prokaryotic expressing vector of SLA-1 derived form Yorkshire pig and express the interest of protein, a pair of primers was designed to amplify the extracellular domain of SLA-1 gene from Yorkshire pig (named SLA-1-DYKe) by PCR. Then the PCR product was cloned into pMD®19-T Simple Vector and transformed into Escherichia coli TOP10. After cleaved by Nde Ⅰ and Xho Ⅰ, the positive clones were selected to be sequenced. Analyzing by biological soft, the fragment from positive clone with correct sequence was inserted into pET-28a (+) and transformed into E.coli BL21(DE3). After induction and expression, the interest of protein was detected by SDS-PAGE. The results showed that the extracellular domain of SLA-1-DYKe was successfully amplified with the fragment length of 837 bp. The interest of SLA-1 gene was successfully cloned into pMD®19-T Simple Vector and the positive recombinant plasmids with correct sequences were obtained. The SLA-1-DYKe from positive recombinant plasmids was further inserted into pET-28a(+). After transformed into E.coli BL21(DE3) and induction, the SLA-1-DYKe was successfully expressed. The molecular weight of the protein was about 34 ku. It was concluded that the prokaryotic expressing vector of SLA-1 was constructed successfully from Yorkshire pigs and then the expressed protein was obtained, which would lay a base for studying on the structure and function of SLA-1 from Yorkshire pig in the future. 相似文献
15.
为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。 相似文献
16.
从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。 相似文献
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猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。 相似文献
18.
为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
19.
本研究旨在克隆小尾寒羊钙粘和蛋白1(Calcium and integrin binding protein 1,CIB1)基因cDNA全长,并在原核载体中表达.参照已发表的CIB1基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用RT-PCR法,从小尾寒羊睾丸组织中扩增获得CIB1基因全长cDNA.将其克隆到pMD19-T载体,并进行测序分析.将该基因编码区重组于融合表达质粒pET32a中,构建了重组原核表达载体(pET32a-CIB1).将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.结果表明,克隆的CIB1基因cDNA与GenBank上登录的牛、猪、猕猴、人、小鼠、大鼠、黑猩猩等动物该基因序列的同源性达90%以上,编码氨基酸的同源性在93%以上,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为576 bp.实现了高效特异性融合表达,表达产物的分子质量约为38 ku.本研究结果为进一步研究CIB1蛋白功能打下良好的基础. 相似文献
20.
本试验旨在利用大肠杆菌BL21（DE3）表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物,经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达,约在38 ku处可见清晰的表达产物,诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此,本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。 相似文献