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1.
为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,本试验对水牛iPS细胞转录因子Sox2与细胞穿膜肽HIV TAT进行融合表达,以获得具有自主穿膜功能的Sox2蛋白,建立非转基因水牛iPS生产技术体系。首先人工合成了HA2-TAT序列,并将pET-32a（＋）质粒改造为pET-HA2-TAT基础表达载体,再通过双酶切定向克隆将水牛Sox2基因插入pET-HA2-TAT得到原核表达载体pET-NLS-Sox2-TAT;重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测融合蛋白表达,再用Ni 2＋柱进行纯化融合蛋白。结果表明,成功表达了融合蛋白HA2-TAT（24 400）和NLS-Sox2-TAT（57 700）;纯化蛋白NLS-Sox2-TAT在咪唑浓度为365.30mmol/L时,出现蛋白洗脱峰,经Western blot验证表达的融合蛋白具有免疫原性。 相似文献
2.
《畜牧与兽医》2016,(12):76-78
为了研究水牛ghrelin基因的结构与功能,本试验对水牛ghrelin基因进行原核表达载体构建与融合蛋白表达条件的优化。采用RT-PCR方法从水牛胃组织的总RNA中扩增出ghrelin编码区,连接到pRSET-a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆子,用IPTG进行诱导表达条件的优化。结果表明,成功构建原核表达载体pRSET-a-ghrelin,在2 mmol/L IPTG,37℃的条件下诱导表达4 h,水牛ghrelin重组蛋白可成功获得表达,经SDS-PAGE鉴定发现,ghrelin融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 ku,其表达量占总菌体蛋白量的35%。本试验结果为进一步研究水牛ghrelin基因的结构和功能提供有价值的生物学信息。 相似文献
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4.
《中国畜牧杂志》2015,(19)
本研究克隆水牛特异性转录因子Sox2和Lin28,构建表达载体,为进一步研究2个基因在水牛干细胞多能性调控中的作用奠定基础。以胎牛生殖嵴总RNA为模版,采用RT-PCR扩增Sox2和Lin28的编码区序列(CDS),构建逆转录表达载体pMSCV-Sox2和pMSCV-Lin28,转入NIH3T3细胞,鉴定其表达情况。结果表明:水牛Sox2和Lin28的CDS全长分别为966 bp和618 bp,蛋白结构保守;Sox2、Lin28氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为96%、95%、94%、94%和98%、97%、89%和91%;pMSCV介导的Sox2和Lin28能在NIH3T3细胞中表达。 相似文献
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山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白.应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体.重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白.结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmo|·L-1 IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku).结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件. 相似文献
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试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155 bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70 ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8 mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8 mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著（P>0.05）。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。 相似文献
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水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku. 相似文献
8.
本试验对水牛SERPINE2基因进行生物信息学分析，探索其在水牛不同组织器官中的表达规律，旨在为研究SERPINE2在水牛生殖过程中的具体调控机制提供理论支持。利用PCR技术克隆水牛SERPINE2基因CDS区的全长序列，在线生物信息学分析程序对SERPINE2进行分析，实时荧光定量PCR技术检测SERPINE2 mRNA在水牛不同组织的表达水平。结果表明：SERPINE2基因CDS区长度为1 191 bp，编码397个氨基酸，通过分析相似性结果，发现水牛和牛、绵羊、山羊的相似性为99.6%；系统进化树结果显示，遗传距离最近的是水牛和牛，绵羊次之。在组成SERPINE2蛋白的氨基酸中，缬氨酸含量较高，占氨基酸总数的9.6%。SERPINE2蛋白是一种不稳定的亲水蛋白，SERPINE2有一个信号肽，没有跨膜结构域。SERPINE2蛋白的二级结构中，α-螺旋结构的占比最高，为41.56%。多个器官检测出SERPINE2 mRNA的表达，其中在卵巢的表达量显著高于其他器官，说明SERPINE2基因可能与卵巢生长发育有重大联系。 相似文献
9.
为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。 相似文献
10.
本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。 相似文献
11.
Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。 相似文献
12.
本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。 相似文献
13.
本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。 相似文献
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本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。 相似文献
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本研究克隆了水牛骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein-1,BMP1)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还运用实时荧光定量PCR技术对BMP1基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆得到水牛BMP1基因的cDNA序列长度为3 195 bp,其中包含完整的2 967 bp的开放读码框(ORF),编码988个氨基酸。经序列相似性分析显示,水牛BMP1基因与牛、猪、马、人和小鼠相应氨基酸序列相似性分别为99%、96%、96%、96%和95%,具有很强的保守性。结合系统进化树分析结果推测,BMP1基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛BMP1蛋白的结构域预测结果发现,其存在1个信号肽区、1个前肽区、1个金属蛋白酶区、5个CUB区和2个EGF-like功能区。定量表达分析结果显示,BMP1基因在水牛心脏组织中相对表达量最高,睾丸、卵巢和生殖嵴等性腺器官表达量次之,骨头等其他组织表达量较低,肝脏表达量最低。 相似文献
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试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究.根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析.结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599 bp,共编码532个氨基酸.多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%.系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性.对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构.定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低.本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础. 相似文献
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本研究旨在克隆水牛SIRT6基因，构建真核表达载体，并对该基因进行生物信息学及组织表达谱分析。以牛SIRT6基因编码区为种子序列（GenBank登录号：NM_001098084.1），应用Oligo 7.0软件设计引物序列，用RT-PCR方法扩增水牛SIRT6基因完整编码区序列，测序鉴定后进行生物信息学分析，构建逆转录病毒载体pMXs-SIRT6-IRES-GFP，并在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞上进行重组载体表达鉴定；采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴分别提取RNA，反转录后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测SIRT6基因在各组织中的表达差异。结果表明，水牛SIRT6基因编码区全长1 080 bp，编码359个氨基酸，其中亮氨酸及脯氨酸含量最高（10.3%），酪氨酸含量最低（1.1%）。水牛SIRT6基因核苷酸序列与牛、人和小鼠的同源性分别为98.4%、86.7%和78.5%，物种间同源性较低。系统进化树结果表明，水牛与牛聚为一支，再与人、小鼠聚为一大支，亲缘关系相对较近，与果蝇亲缘关系较远。SIRT6蛋白理论分子质量为39.47 ku，分子式为C1737H2783N509O516S13，等电点为8.48，不存在跨膜区，为膜内蛋白；含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构。二级结构预测结果显示，水牛SIRT6蛋白包含13个α-螺旋、27个β-折叠、24个T-转角和20个无规则卷曲。逆转录病毒载体介导的SIRT6基因能在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞中表达。实时荧光定量PCR结果显示，SIRT6基因在水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴中均有表达，其中在生殖嵴中表达量最高，在皮肤中的表达量次之，而在肝脏中表达量最低。本试验结果将为水牛SIRT6基因的功能研究提供参考。 相似文献
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本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。 相似文献
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为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。 相似文献