共查询到20条相似文献，搜索用时 218 毫秒
1.
《动物医学进展》2015,(10)
为建立膜连蛋白A2(AnxA2)基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank中公布的AnxA2基因序列设计并合成引物,经过条件优化,建立了AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.999;灵敏性好,比普通PCR灵敏100倍。应用建立的方法对随机选取的几种哺乳动物细胞进行检测。结果表明,建立的方法能成功检出不同细胞中AnxA2含量。表明本研究建立的AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏性高,重复性好,可用于AnxA2的检测及定量分析。 相似文献
2.
为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。 相似文献
3.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(21)
为建立一种快速准确检测犬巴贝斯虫(Babesia cains,B.canis)的方法,试验根据GenBank中收录的巴贝斯虫18S rRNA序列设计一对特异性引物,对建立的基于SYBR GreenⅠ检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR方法进行了研究。结果表明:建立的实时荧光定量PCR方法可准确检测出10拷贝/μL的样本,灵敏度是常规PCR的1 000倍;该方法可以特异地检测巴贝斯虫,对6个对照组的检测结果均为阴性;批内和批间变异系数均低于5.00%;对豫西地区收集的21份临床样品进行检测,实时荧光定量PCR方法的阳性率为66.7%,普通PCR方法的阳性率为55.1%,血涂片法的阳性率为33.3%。说明该方法可用于临床疑似巴贝斯虫感染犬的早期检测和确诊。 相似文献
4.
《中国家禽》2019,(22)
利用禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)YBF02株VP1基因序列设计一对特异性引物,通过对反应体系条件的确定和阳性质粒标准曲线的建立,建立了用于快速检测AEV含量的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR。结果显示:该方法能特异性地检测AEV YBF02株,且与其他禽类病毒无交叉反应;敏感性试验表明,该方法最低能检出10拷贝的AEV RNA模板,为普通PCR的100倍;使用该方法和鸡胚半数感染量(EID50)法对样品进行检测,二者具有良好的线性关系,且重复性试验的变异系数均小于4%。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR敏感性高、特异性强、重复性好,为AEV含量的快速检测提供了一种新的技术手段。 相似文献
5.
《中国动物传染病学报》2017,(3)
为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中可能存在的鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)污染,根据CIAV基因组保守区域VP2部分基因设计和合成了1对特异性引物,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达6.36 copies/μL,是常规PCR灵敏度的1000倍。该方法与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)、鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)等均无交叉反应,特异性良好;批内和批间重复试验显示变异系数均小于2.5%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,建立的SYBR Green I荧光定量PCR能够检测到1000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的14种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性,阳性样品按照经典的SPF鸡检查法进行检测也为CIAV阳性。因此,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,适合用于疫苗中CIAV污染的检验。 相似文献
6.
为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。 相似文献
7.
为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.998 9;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×102 copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2016,(6):917-922
利用DNAStar对GenBank上发布的坦布苏病毒(TMUV)的E基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性引物。按照相同的方法,设计另1对鼠源内参基因β-actin的引物。通过PCR扩增获得E和β-actin的部分片段,分别与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,分别用于实时荧光定量PCR中E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建。通过对反应条件进行优化,建立了以β-actin为内参基因的检测鼠或鼠源细胞中TMUV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对TMUV的最低检出量为10个拷贝,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.45%;特异性试验的结果表明,该方法只能检测到TMUV的扩增曲线。对50份样品进行检测,该方法的检出率为100.00%(普通PCR为87.50%),并对组织中病毒载量进行了相对定量,进一步说明了该方法的敏感性高,可用于试验样品的检测,为研究该病毒对哺乳动物的致病特性提供特异性的检测方法。 相似文献
9.
鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测. 相似文献
10.
鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。 相似文献
11.
为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×101 copies/μL和1.0×102 copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。 相似文献
12.
分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。 相似文献
13.
《动物医学进展》2021,42(2)
根据近5年来GenBank发布的猪A群轮状病毒(RVA)VP6基因序列,针对保守区域设计1对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了TB Green实时荧光定量PCR方法。该方法在模板浓度为1.06×10~8 copies/μL～1.06×10~2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数R~2=0.997 5,最低检出浓度为106 copies/μL;批内及批间变异系数小于2%。利用该方法对猪RVA亚型G3、G4、G5、G9和G26检测均为阳性,而对猪常见病原(猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪呼肠孤病毒MRV、猪捷申病毒、巴氏杆菌、链球菌以及猪等孢球虫)检测均为阴性。对91份临床腹泻样品进行检测,研究建立的猪RVA TB Green实时荧光定量PCR检出率(43.96%,40/91)高于已报道的猪RVA SYBR Green荧光定量PCR(42.86%,39/91)和国家标准RVA的普通RT-PCR(12.09%,11/91),且符合率为100%。建立的RVA荧光定量PCR检测方法为流行病学调查和早期诊断提供了技术支撑。 相似文献
14.
为了建立一种快捷、特异、敏感的检测猪圆环病毒3型(PCV3)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的PCV3全基因组序列,在rep基因高度同源保守区设计并合成1对特异性引物,从阳性病料DNA中PCR扩增PCV3rep基因。PCR产物克隆入pMD~18-T载体中,构建重组质粒(pMD18-PCV3rep),转化到大肠杆菌DH-5α中。经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品模板,经过反应条件优化,建立了检测PCV3的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法线性关系良好,R2=0.998 2;仅PCV3阳性病料出现特异性扩增,而与另外6种病原无交叉反应;该方法检测下限为21.9copies/μL;批间及批内变异系数分别为0.394%~0.935%和0.112%~0.775%,均小于1%。经临床应用证实,该方法具有良好地特异性、敏感性和稳定性,为PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术支持。 相似文献
15.
用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。 相似文献
16.
为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。 相似文献
17.
SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法检测猪细小病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立特异敏感的猪细小病毒(PPV)的SYBR Green I实时定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上PPV NS1保守序列设计合成了1对引物,利用本实验室构建的重组质粒(pMD18-T-PPV NS1)为标准模板,对反应条件进行优化,绘制标准曲线,并进行熔解曲线分析,建立了PPV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法.分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明,本方法具有良好的特异性,与PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2、SIV及阴性对照均为阴性;其最低检出量为7copies/μL,比PCR敏感100倍,且批内和批间重复性良好.用该方法对15份临床病料进行检测,并与常规PCR、环介导等温扩增(LAMP)方法进行对比,显示该方法灵敏度高、成本低,能够对样品组织中病毒进行定量检测,为快速检测PPV提供了有效的技术手段. 相似文献
18.
《中国动物传染病学报》2020,(4)
本研究以新型鸭细小病毒VP3基因保守区域克隆至pMD19-T载体上获得的阳性质粒作为标准阳性质粒,建立一种检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:在5.17×10~1～5.17×10~7拷贝数呈良好的线性关系,相关系数R~2为0.999、斜率为3.595,灵敏度可达到5.17拷贝数;该方法用于检测鸭常见传染病呼肠孤(DRV)、禽流感(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭星状病毒(DAstV)无非特异性扩增,特异性良好;对安徽、山东、江苏等地鸭场采集的疑似病料进行初步检测,发现48份样品中阳性率达70.8%,与普通PCR方法检测结果相比,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法更灵敏。本研究成功建立了一种检测新型鸭细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量方法,为新型鸭细小病毒的监测奠定了坚实基础。 相似文献
19.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。 相似文献
20.
本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。 相似文献