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1.
为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
2.
利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
3.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
利用RT-PCR技术扩增了禽源H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangxi/7/2007(H9N2)的8个目的基因片段,分别克隆至pBD双向转录表达载体。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,54 h后收集上清,接种MDCK细胞。当拯救的病毒在MDCK细胞上增殖至第3代时,收集的细胞上清经检测具有血凝效价。经过测序分析,确定获救病毒的8个基因片段序列与野生株完全一致,表明病毒拯救成功。禽源H9N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的成功建立为探索猪流感病毒致病机理、传播机制与基因功能研究奠定了基础。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(12)
以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞,从而成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株SH/PR8。以相同病毒剂量接种MDCK细胞,检测不同时间点的血凝效价,绘制病毒生长曲线,结果表明,重组病毒SH/PR8相对于原始野生株SH1在MDCK细胞上具有更高的病毒滴度。重组病毒SH/PR8制备的灭活疫苗经过一免和二免小鼠后,检测血清中血凝抑制抗体、中和抗体和IgG抗体,结果显示首免后抗体效价持续升高,4周后抗体效价达到峰值。小鼠攻毒试验结果表明,免疫组体质量下降不明显且未出现死亡,而非免疫组小鼠体质量持续下降并且于攻毒后6d小鼠出现100%死亡。肺脏组织病毒含量滴定以及组织病理学观察结果显示,免疫组能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。总之,本研究表明重组SH/PR8疫苗候选株相对于原始毒株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力,制备的重组灭活疫苗能够诱导机体产生高水平的抗体,能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供很好的免疫保护。 相似文献
5.
一株欧洲类禽H1N1猪流感病毒的分离鉴定与反向遗传系统的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流感是猪常见的呼吸道传染病,临床以高热、呼吸困难、咳嗽和衰竭、迅速康复或死亡为特征。猪流感不仅给养猪业造成巨大损失,也严重威胁着人类健康。本研究从发病猪场中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒,序列分析结果显示,分离毒株属于欧洲类禽猪流感H1N1亚型病毒。将分离毒株分别接种到MDCK与ST细胞,观察病毒的生长特性,结果显示分离的猪流感病毒在ST细胞中复制能力较强。采用RT-PCR技术分别扩增8个基因片段,克隆到流感病毒反向遗传系统,成功拯救出猪流感病毒毒株,测序结果显示拯救的猪流感病毒与亲本毒序列一致。本研究成功分离的猪流感病毒,以及建立的反向遗传技术为研究欧洲类禽猪流感病毒跨种传播的机制以及研发新型猪流感疫苗株奠定了基础。 相似文献
6.
利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。 相似文献
7.
《畜牧兽医学报》2016,(3)
旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。 相似文献
8.
H9N2亚型禽流感病毒通常在鸡胚上增值性能高,但在细胞上增值能力差。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株,通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2,SH441)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)的6个内部基因进行人工重组,拯救并获得了1株禽流感重组病毒441-PR8,并对它的生物学特性进行了研究。结果表明,重组病毒441-PR8株在细胞上的增殖能力明显高于野生毒株SH441,该重组病毒有望成为H9N2亚型禽流感疫苗研制的候选毒株。 相似文献
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10.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
H9N2亚型禽流感病毒普遍存在于我国大部分地区,宿主范围较广,是世界卫生组织发布的最具大流行潜力的病毒之一。为了利用H9N2亚型禽流感病毒表达绿色荧光蛋白(green fl uorescent protein,GFP),通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/2093/2009(H9N2)(SH2093)毒株的NS2基因连接到PB1基因下游,同时将GFP基因连接在NS1基因之后,拯救并获得了1株表达GFP的重组病毒SH2093-GFP。虽然SH2093-GFP在MDCK细胞上的增殖能力低于野生毒株SH2093,但该病毒可以成功表达GFP,为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒作为外源基因表达载体等提供重要依据。 相似文献
11.
近年来Clade2.3.2H5N1亚型的禽流感病毒逐渐成为我国及越南等其他一些国家流行的优势毒株,并呈现出一定变化规律的氨基酸进化趋势。本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.3.2H5N1亚型AIV A/chicken/Yangzhou/1117/2011(YZC3)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的COS-1细胞中救获低致病性的疫苗毒株。结果成功拯救出1株重组病毒rYZC3,该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,对SPF鸡和鸡胚无致病性。本研究为防控当代流行的H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。 相似文献
12.
将H8N4亚型流感病毒的HA和NA基因插入双向转录/表达载体pHW2000中,并与本实验室保留的适应毒株A/PR/8/34(H1N1)的6个质粒pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS共转染293T和MDCK混养细胞,在细胞内部完成病毒粒子的组装,然后接种SPF鸡胚,经3代扩毒后,成功拯救了H8N4亚型重组流感病毒,并对其进行鉴定及生物学特性分析。本研究结果为该亚型禽流感病毒变异机理研究及疫苗的研制等奠定了基础。 相似文献
13.
为获得高效表达犬流感病毒(CIV)HA和NA抗原的疫苗株,本实验通过反向遗传操作技术将A/canine/Zhejiang/01/2010(H3N2)犬流感病毒(简称ZJCIV)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒(PR8)的6个内部基因进行重组,拯救并获得了一株重组病毒CIV-PR8。分别用含100 EID50的CIV-PR8和ZJCIV感染SPF鸡胚,含2×103TCID50的CIV-PR8和ZJCIV感染MDCK细胞,不同时间段取病毒样品测定血凝效价和TCID50值。两者比较表明,CIV-PR8分别在接种后36 h和48 h时血凝效价达到峰值,鸡胚尿液中效价可达210,为野生病毒株的16倍;细胞上清血凝价可达28,为野生病毒株的4倍;病毒增殖曲线表明通过鸡胚扩增和细胞扩增,CIV-PR8的滴度均高于野生病毒株ZJCIV。结果表明,拯救的CIV-PR8增殖能力明显高于野生病毒株ZJCIV,该重组病毒有望成为犬流感疫苗研制的候选病毒株。 相似文献
14.
《中国家禽》2017,(4)
近年来clade2.3.2.1c中的H5N1亚型禽流感病毒的抗原性发生了很大变化,Re-6疫苗并不能对其提供有效保护。为对该分支毒株进行有效防控,研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)毒株为内部基因供体,以clade2.3.2.1c的H5N1亚型毒株A/chicken/Jiangsu/YB7/2015(YB7)的HA和NA基因作外部供体,并删除YB7株HA中裂解位点处的多个碱性氨基酸,通过反向遗传方法成功拯救出1株重组病毒r YB7。r YB7株病毒在鸡胚和MDCK细胞上均有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。本实验室在对毒株抗原性研究的基础上研发的疫苗候选株为防控变异的clade2.3.2.1c的禽流感病毒提供了良好的疫苗备选。 相似文献
15.
《畜牧与兽医》2017,(1):61-64
为建立1株猪源2009/H1N1流感病毒A/swine/Heilongjiang/44/2009(HLJ44)的反向遗传系统,利用双向表达质粒p HW2000,分别构建了该病毒株8个基因节段的重组质粒,将其共转染于293T和MDCK混合培养的细胞,拯救出重组病毒R-HLJ44。测序结果表明,R-HLJ44与亲本病毒HLJ44的核苷酸序列完全一致;二者在细胞上具有相似的增殖特性;抗原性未发生变化;分别以106TCID50的剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,结果显示R-HLJ44与亲本HLJ44在小鼠脏器中的复制滴度也基本一致。以上结果表明拯救的重组病毒保持了与亲本病毒一致的生物学特性。该病毒反向遗传系统的建立,为进一步研究H1N1亚型流感病毒的致病分子机制及新型疫苗研制等奠定了基础。 相似文献
16.
采用RT-PCR技术对分离的H1N1亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,进行序列测定。同源性分析结果表明,分离毒株与其他H1N1亚型猪流感病毒的HA基因核苷酸同源性为70.7%～90.8%,与A/swine/Zhejiang/1/2007的同源性最高,与其他毒株的同源性相对较低。系统进化树分析结果表明,山东分离株的HA基因与欧洲谱系猪流感病毒进化关系最近,证明该分离株可能来源于北美谱系和欧亚谱系猪流感病毒的重组。 相似文献
17.
为了构建H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017的反向遗传操作平台,通过RT-PCR技术分别扩增该毒株的8个基因片段,并分别克隆至双向转录表达载体PHW2000中.8个质粒共转染293T/MDCK混合细胞,96 h后将细胞板反复冻融3次收获细胞悬液,将其接种10日龄SPF鸡胚,96 h后收集尿囊液并将拯救毒株命名为rH9N2,测定其HA效价为1:256.rH9N2在HA、MDT、EID50、TCID50以及病毒生长曲线、空斑等方面保持了与亲本毒株一致的生物学特性.本研究成功构建了A/Chicken/Shandong/LY1/2017的感染性克隆,为今后通过基因替换、定点突变技术研究H9N2亚型禽流感病毒致病性的分子机制奠定了基础. 相似文献
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采用RT-PCR技术对分离的H1N1亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增,将获得的PCR产物与pMD18-T载体连接,进行序列测定.同源性分析结果表明.分离毒株与其他H1N1亚型猪流感病毒的HA基因核苷酸同源性为70.7%～90.8%,与A/swine/Zhejiang/1/2007的同源性最高,与其他毒株的同源性相对较低.系统进化树分析结果表明.山东分离株的HA基因与欧洲谱系猪流感病毒进化关系最近,证明该分离株可能来源于北美谱系和欧亚谱系猪流感病毒的重组. 相似文献
19.
为制备一株猪流感灭活疫苗的候选毒株,本研究利用反向遗传学技术,将A/swine/Guangdong/1/11(H1N1)毒株的HA、NA基因和A/PR/8/34毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因进行重组,成功拯救出鸡胚高度适应性毒株rH1N1。抗原性分析显示rH1N1保留了亲本毒株良好的抗原性。rH1N1接种10日龄鸡胚48 h后,血凝价达到210,表明该毒株能在鸡胚中高水平复制。该毒株为H1N1亚型猪流感灭活疫苗的研制奠定了坚实的物质基础。 相似文献
20.
《畜牧与兽医》2021,(5)
为了解2018年江苏养殖场分离的1株H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/76/2018 (JS/76)的遗传变异情况,对其HA基因进行了测序和遗传演化分析,并且成功构建JS/76的反向遗传操作系统。HA基因演化分析结果显示,JS/76毒株的HA基因裂解位点为PSRSSR↓GLF,是典型低致病性禽流感病毒(LPAIV)的特征序列。其216位氨基酸为亮氨酸(L),具有哺乳动物α-2, 6唾液酸受体结合特征,并且在127位氨基酸额外增加了一个潜在糖基化NGT。随后,基于流感病毒的"12质粒系统"成功拯救该病毒,命名为r-JS/76,测定其血凝价为1∶1 024。结果显示,r-JS/76在EID_(50)和TCID_(50)等方面保持了与亲本毒株相似的滴度。体外试验证明,拯救毒株与野生毒株在SPF鸡胚和MDCK细胞上的复制能力保持一致,受体结合试验表明拯救病毒与亲本病毒均具有人源受体结合特征,可能已获得感染哺乳动物和人的能力。本研究对H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传演化进行分析并成功建立其反向遗传操作技术平台,为今后探索H9N2流感病毒致病机理、传播机制与基因功能等研究奠定了基础。 相似文献