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1.
猪β-防御素-2转化酿酒酵母方法的比较分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立操作简单、高效率的猪β-防御素-2转化酿酒酵母的方法,试验比较了酿酒酵母的两种转化方法,即电转化和醋酸锂法。结果显示,两种转化方法对细胞生长状态均有严格的要求。在醋酸锂转化中,以培养10 h,D600 nm为1.051的细胞制备感受态,热激时间为60 min时,转化率为136个/μg DNA;在电转化中,以培养12 h,D600 nm为1.359的细胞制备感受态,电击电压2.5 kV时转化效率为154个/μg DNA。但综合操作效率,最终选择醋酸锂法进行酿酒酵母的转化。 相似文献
2.
为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D600 nm值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。 相似文献
3.
以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明：在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1．2μg／μL的质粒,在电场强度和脉）中时间分别为10kV／cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2．6×10^4CFU／μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。 相似文献
4.
无菌采集陕北白绒山羊瘤胃内容物,梯度稀释后涂布CaCO3-MRS培养基,厌氧培养分离乳酸杆菌,并对分离菌株的生长、发酵液pH、酸耐受性、胆盐耐受性、抑菌性及有无内源质粒等生物学特性进行了比较研究。结果显示:从陕北白绒山羊瘤胃液中共分离出11株乳酸杆菌,经16S rDNA比对鉴定,分别是植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)4株(ZW-4、ZW-8、ZW-10、ZW-11),干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)2株(GL-1、GL-5),罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)2株(LY-6、LY-7),短乳杆菌(Lactobacillus brevis)1株(DR-9),棒状乳酸杆菌(Lactobacillus coryniformis)1株(BZ-2)及弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)1株(WQ-3)。在相同培养条件下,植物乳酸杆菌ZW-4和干酪乳酸杆菌GL-1生长、产酸以及抑菌能力较强,同时植物乳酸杆菌ZW-4对胆盐和酸的耐受能力强于其他菌株;在上述菌株中,仅罗伊乳酸杆菌LY-7没检测到内源质粒,而植物乳酸杆菌ZW-4有6个内源质粒,明显多于其他几株乳酸杆菌。结果表明,分离自陕北白绒山羊瘤胃的植物乳酸杆菌ZW-4和干酪乳酸杆菌GL-1具有优良生物学特性,初步具备了作为益生菌使用的基本条件。 相似文献
5.
为了探明电场对卷荚相思(Acacia cincinnata)种子的生理响应,以卷荚相思种子为试验对象,设置相同时间(60 min)处理下不同电场强度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 kV·cm-1)的试验组和对照组(CK,0 kV·cm-1),研究电场处理对种子萌发和生理特性的影响。结果表明：卷荚相思种子的发芽势、发芽指数和发芽率在适宜的电场处理下与CK相比有一定程度的提高;相对电导率在电场强度0.8和0.6 kV·cm-1下与CK相比显著降低(P <0.05);丙二醛含量在电场强度0.6kV·cm-1下与CK相比显著降低(P <0.05);酶活性在电场处理下呈不同变化趋势,过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性随电场增强呈现先升后降的趋势,过氧化氢酶活性随着电场的升高呈现先下降后上升再下降的趋势。结构方程模型综合分析表明,电场处理对过氧化物酶和相对电导率有极显著(P <0.001)的影响,酶活性互相具有极显著的影响(P <0.001),丙二醛、过氧化物酶和过氧化氢酶对发芽率... 相似文献
6.
为了构建重组犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增CDV F-H融合基因。将F-H融合基因亚克隆至穿梭载体p SIP409多克隆位点上,构建p SIP-F-H表达重组子,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting检测F-H融合蛋白的表达情况。结果表明,成功地扩增了CDV F-H融合基因,构建了p SIP-F-H重组表达质粒,并电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为62.96 ku的F-H融合蛋白,且该蛋白能与CDV阳性抗体反应,具有反应原性。 相似文献
7.
《中国家禽》2017,(13)
选择产气荚膜梭菌坏死性肠炎毒素B(NetB)为抗原,构建产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌,利用植物乳酸杆菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-NetB,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,NetB重组蛋白相对分子质量为36 ku。重组质粒pSIP409-NetB电转化植物乳酸杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌NetB蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。 相似文献
8.
【目的】研究刺五加水提物(Acanthopanax senticosus aqueous extract, ASAE)对鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus, MRV)的抑制作用及其对大口黑鲈免疫调节功能的影响。【方法】用不同剂量ASAE(1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL)与MRV同时作用鳜鱼脑细胞系(SCB3),检测ASAE对MRV的抑制活性。在基础饲粮中添加5‰ASAE,连续饲喂大口黑鲈15 d,实时荧光定量PCR和流式细胞术分析ASAE对大口黑鲈免疫功能的影响,并以1×107 TCID50/mL MRV腹腔注射攻毒,分析ASAE抗MRV保护效果。【结果】1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL ASAE对MRV抑制率分别为95.27%、91.36%、84.55%、60.05%、32.16%和2.49%。实时荧光定量PCR结果显示,ASAE诱导大口黑鲈白介素-10(interleukin-10,IL-10)、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase, Lyn)、肌... 相似文献
9.
为探索可用来开发牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白(G)基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒(480-pET-30、1107-pET-30)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,培养阳性菌株D600 nm值为0.6~1.0,37 ℃下用1.0 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107 bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。 相似文献
10.
以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。 相似文献
11.
为了提高水蛭素的生产效率以适应生物医药应用的需求，试验通过对水蛭素基因进行密码子优化，构建了重组水蛭素原核表达系统，并对D600 nm值、诱导时间、诱导剂IPTG浓度和诱导温度4种诱导条件进行了探索，同时通过引入试验设计（design of experiment，DOE）方案将4种因素对诱导效率的影响进行进一步系统的优化，使用His-Trap亲和层析对重组蛋白进行纯化，并通过凝血酶滴定法对重组水蛭素的活性进行测定。结果显示，试验成功构建重组水蛭素原核表达载体，水蛭素蛋白为可溶性表达。单因素变量优化后的诱导条件为：在菌体密度D600 nm值为0.4时，加入1 mmol/L IPTG，37℃下诱导7 h，重组水蛭素蛋白表达效率最高，占菌体总蛋白66.5%；而DOE试验优化结果为：在菌体密度D600 nm值为0.6时，加入0.82 mmol/L IPTG，31.9℃下诱导7.6 h，预测重组水蛭素蛋白表达效率最高，占菌体总蛋白72.7%，显著高于单因子变量法优化结果（P<0.05）。进一步分析发现，各影响因素之间存在明显的交互效应，影响了单因素试验结果的准确性。通过亲和层析纯化后的重组水蛭素纯度可达99%，抗凝活性为114 ATU/mg。研究成功构建了重组水蛭素原核表达载体，对其表达条件进行了优化，并获得了重组水蛭素蛋白，为水蛭素应用于生物医药奠定了基础。 相似文献
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利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37 ℃封闭2 h;血清最适稀释度为1∶100,37 ℃作用2 h;兔抗猪IgG/辣根酶（HRP）（1∶3000）,37 ℃作用2 h;37 ℃避光显色15 min读取D450 nm值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D450 nm值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D450 nm值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。 相似文献
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为测定致羔羊脑炎粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的生长曲线，寻求一种快速而准确的方法测定不同生长时期粪肠球菌数量，并客观评价其毒性强弱及其对小鼠脑组织的影响，试验采用平板菌落计数法和OD-Monitor振荡比浊法（Dλ值法）测定粪肠球菌的生长曲线，探究该菌在合适时间段内的吸光值（D600 nm）与平板菌落计数法测定的活菌数（CFU）的关系。用粪肠球菌感染小鼠，观察记录小鼠的死亡情况，最后采用Karber法计算粪肠球菌感染小鼠的半数致死量（LD50）。用LD50的剂量感染小鼠，及时采集死亡小鼠脑组织，未死亡的小鼠72 h后全部剖杀取脑组织，一部分做涂片染色，制作病理切片，观察病理变化；一部分进行培养，用于PCR方法进行细菌的回收鉴定。结果显示，用两种方法测定此株粪肠球菌的生长曲线基本一致，在2~8 h生长迅速，为对数生长期，8~14 h生长缓慢，为稳定期，14 h之后死亡数增加，进入衰亡期；对12 h粪肠球菌D600 nm与CFU的关系进行探讨，成功建立回归方程：y=20.769x-1.3422，R2=0.997；其感染小鼠的LD50为7.77×1011个活菌。以此剂量感染小鼠，脑组织涂片染色和培养染色，均能看到革兰氏阳性球菌；PCR结果显示，均出现了大小为112 bp的条带。对脑组织进行病理学观察发现该菌可导致脑组织充血、出血、形成微血栓，脑膜充血。通过生长曲线和其D600 nm与CFU关系的建立，可实时监测粪肠球菌数量，为后期更深入研究粪肠球菌穿越血脑屏障的机制奠定重要的理论基础。 相似文献
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柱状黄杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
The aim of this study was to develop a rapid method for the detection of Flavobacterium columnaris based on a double antibody sandwich ELISA （DAS-ELISA）. Purified monoclonal antibody against Flavobacterium columnaris was used as the capture antibody, while polyclonal antibody was used as the detection antibody. The optimal conditions for the ELISA were as follows: monoclonal antibody with 0.08 μg per well was added to coat overnight at 4 ℃; the plate was blocked by 30 g/L bovin serum albumin for 90 min at 37 ℃; incubation concentration of polyclonal antibody was 0.11 μg per well; the incubation time for detection antigen, polyclonal antibody and enzyme labeled antibody was 1 h at 37 ℃ for each; the value of D492 nm was obtained after 15 min coloration. Judging with P/N≥2.1 and D492 nm≥0.776 as positive criteria. This method had no cross reaction with Edwardsiella tarda, E. coli, Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio harveyi. Its minimum detectable limit was 1×103 CFU. Therefore, this study provided a specific and sensitive detection method for Flavobacterium columnaris for the first time. 相似文献
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In order to explore specific candidate gene of antigens and diagnostics development for the bovine ephemeral fever virus (BEFV), the target gene sequences were derived from G gene by PCR amplification using two specific primers.The PCR products were digested by Xho Ⅰ and Nde Ⅰ and cloned into pET-30 vector, and the recombinant plasmids (480-pET-30, 1107-pET-30) were transformed into E.coil BL21 (DE3) cells, the D600 nm of positive strains were 0.6 to 1.0.The recombinant strains were induced by IPTG (1.0 mmol/L) at 37 ℃.The characteristics of the target proteins were analyzed using SDS-PAGE and the immunogenicity was analyzed through Western blotting.At the same time, the target proteins were used as coating antigens to do ELISA and all rabbits were inoculated with recombinant proteins.The results showed that the expression feature of 1 107 bp gene fragment of G gene for the first time was segmented in vitro as well as has nicer biological activity and specificity, and it more be suitable as a candidate gene for molecular vaccine and diagnostics development.This study provided the theoretical foundation of the establishment of diagnostics technique and vaccine for BEFV. 相似文献
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为研究不同浓度的赤霉酸对饲料添加菌生长的影响,用2种不同浓度的赤霉酸溶液单独添加饲料乳酸菌（A4+A7）和纤维素分解菌（Nf+Y6）进行培养52 h,其中每4 h作一个单位测定出OD600 nm值并绘制生长曲线,分析不同浓度的赤霉酸对饲料添加菌生长的影响。结果表明,赤霉酸浓度为10 mg/L时,各组OD600 nm值分别为0.64、0.70、0.84、0.78、0.72,其中试验组2的OD600 nm值与对照组和其他试验组相比有明显增高,总活菌数高达11.6×108 CFU/mL,比对照组（1.63×108 CFU/mL）高7倍以上;当赤霉酸浓度增加到20 mg/L时,各组OD600 nm值分别为0.64、0.60、0.59、0.59、0.63,其中各试验组的OD600 nm值与对照组相比无明显差异（P>0.05）,试验组活菌数（1.60×108 CFU/mL）与对照组相比（1.63×108 CFU/mL）无明显差异（P>0.05）。通过试验数据和生长曲线得知赤霉酸浓度在10 mg/L时能促进乳酸菌和纤维素分解菌的生长繁殖;赤霉酸浓度为20 mg/L时乳酸菌和纤维素分解菌的生长速度明显下降。综上提示,适当添加赤霉酸对饲料添加菌生长有明显的促进作用,赤霉酸浓度过高则饲料添加菌的生长量降低。 相似文献
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试验旨在研究快速、简单、高效提取芽孢杆菌与乳酸菌DNA的方法。在微波炉额定功率800 W下,对芽孢杆菌和乳酸菌进行微波处理40~150 s,离心获取上清,收获细菌DNA,将样本DNA PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证,测定其纯度和产量后测序。结果显示,在微波炉功率800 W条件下加热40~150 s均可有效提取芽孢杆菌与乳酸菌DNA。所得DNA质量较好（D260 nm/D280 nm在1.8~2.1之间）。DNA浓度符合PCR检测要求,目的条带清晰,所得测序结果满足常规分子生物学研究。该微波提取方法具有简单、快速、高效的特点,且具有广泛的实用性,为乳酸菌与芽孢杆菌快速分子检测提供了简便手段。 相似文献