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1.
N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。 相似文献
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为提高猪圆环病毒(PCV)的滴度,以本实验室已成功分离的1株PCV2d流行毒株PCV2RC160307为模板,通过融合PCR突变其Rep蛋白上的1个N-糖基化位点,并成功构建自身环化感染性克隆HT-PCV2,转染ST细胞,盲传至F8代后,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)及过氧化物酶单层试验(IMPA)进行验证,并通过IMPA测定TCID50发现,拯救成功的HT-PCV2病毒滴度为105.2×TCID50/0.1mL,较分离的流行毒株RC160307及未糖基化位点突变的感染性克隆H-PCV2的病毒滴度有所提高。此种方法为PCV2复制机制的进一步研究疫苗的研制及其疾病的预防奠定基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
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旨在筛选PK-15细胞中与猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）复制起始区（origin of replication,Ori）互作的细胞蛋白谱,并初步探究PARP1蛋白对PCV2复制的调控。利用DNA-protein pull down结合LC-MS/MS方法筛选PCV2复制起始区DNA互作蛋白;对互作蛋白进行GO分析以及KEGG通路富集分析,并绘制蛋白互作网络图。在对互作蛋白进行分析的基础上,选择聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）蛋白,开展了深入研究。构建了PARP1蛋白以及PCV2复制蛋白Rep真核表达质粒,并利用DNA-protein pull down及DNA IP试验验证PARP1蛋白与PCV2 Ori的互作;通过Co-IP试验,研究了PARP1蛋白与PCV2 Rep蛋白的互作;在细胞中过表达或沉默PARP1蛋白,通过qPCR方法检测对PCV2复制的影响。本研究共鉴定到130种可能与Ori互作的宿主蛋白,其中,与DNA功能相关的蛋白共有45种,主要涉及宿主DNA损伤修复及DNA复制功能;验证了PARP1蛋白与PCV2基因组Ori以及Rep蛋白互作。用siRNA沉默PARP1蛋白表达后,PCV2基因组复制效率显著下降,瞬时过表达PARP1蛋白,PCV2基因组复制效率显著提高。综上所述,本研究筛选到130种可能与PCV2 Ori互作的细胞蛋白,发现PARP1蛋白可结合PCV2基因组Ori及Rep蛋白并促进PCV2的复制,为PCV2药物靶点选择及PCV2复制起始过程研究奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白（Rep）和核衣壳蛋白（Cap）,其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV）,与腺病毒骨架载体（pAdEasyTM）共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒tAd-Cap,测定其TCID50为1015．7／mL。用RT—PCR、间接ELISA、Westernbfot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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为了构建Rep蛋白真核表达质粒，研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因，并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示，重组的pEGFP—PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP—PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h，PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(4)
为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)与参考毒株之间在分子生物学水平上的差异以及病毒驯化过程中的遗传变异情况,将分离的猪圆环病毒2型MNS株在PK-15细胞上盲传35代,并对4个代次病毒全基因组进行测序与分析。间接免疫荧光试验结果表明,感染细胞的细胞核中可以观察到特异性绿色荧光。病毒传代驯化到第35代后,病毒对细胞的适应性显著提高,病毒含量最高可达107TCID50/m L。对4个代次接种病毒Z0、Z3、Z19、Z35进行全基因组测序,结果表明,4代次细胞毒与PCV2参考毒株之间的全基因组序列同源性为93.9%~96.3%,与参考株af55394(PCV2b)核苷酸同源性较高。4代次细胞毒之间全基因组序列同源性为99.7%~99.9%,通过分析PCV2全基因组中碱基突变结果,发现各代次细胞毒与参考毒株之间存在19处点突变,16处点突变发生在ORF1中,3处发生在ORF2中。其中,ORF1 751~753 nt处发生基因颠换(TACGC→TTTTG)现象。本研究结果对今后进行PCV2复制机制、遗传变异以及开发高效价的病毒灭活疫苗等方面的研究奠定了基础。 相似文献
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为构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,采用PCR方法从已鉴定为PCV2阳性的病料中扩增PCV2全长基因组片段后将其定向克隆至PVAX1载体中,构建了PCV2感染性克隆质粒p VAX1-PCV2;将重组质粒转染细胞进行病毒拯救,通过免疫过氧化物酶和RT-PCR进行拯救病毒检测,并初步测定了拯救病毒在体外细胞培养的增殖能力和遗传稳定性。结果表明,构建的PCV2感染性克隆质粒,成功拯救出PCV2,拯救病毒盲传8代后毒价可达104.78TCID50/m L,体外增殖能力较为稳定。本试验为深入研究PCV2的基因功能及致病机制等奠定基础。 相似文献
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设计了1对特异性引物,从疑似PMWS（断乳仔猪多系统衰竭综合征）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-B）。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子（命名为PCV2-B）。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3＋和CD4＋整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(10):1658-1664
为对猪圆环病毒iDNA新型疫苗、基因组遗传变异以及基因组结构与功能等研究提供科学依据,运用相关生物信息学软件对猪圆环病毒2型(PCV2)贵州仁怀分离株(GZ-RH1)的基因组遗传特征进行了分析。结果表明,PCV2GZ-RH1株基因组结构与pmws(AF027217)株相比存在较大差异,其ORF2基因的第696位因碱基T的缺失而导致移码突变,致使其缺失了ORF8和ORF11,ORF5和ORF10终止密码子提前,其他ORF相对较为保守。PCV2GZRH1株各编码蛋白中除了ORF4和ORF9外,其余都属于亲水性蛋白,且ORF9含有1段信号肽序列。在ORF1和ORF2编码蛋白的磷酸化位点中,ORF1相对较为保守,而ORF2变异较大。ORF1~3所编码的蛋白除均具有各自的蛋白质家族域外,还预测到一些可能具有特殊功能的结构域,如ORF1编码蛋白的NACHT结构域和ORF2编码蛋白的精氨酸富集区。ORF2编码氨基酸位点熵值分析表明,ORF2蛋白氨基酸序列中包含2个高变区,即第53~91位和185~215位。通过构建进化树显示,GZ-RH1分离株系PCV2b亚型。对GZ-RH1株的密码子偏爱性分析表明,相对于大肠杆菌和酵母而言,昆虫细胞更适合于PCV2ORF2基因的体外表达。 相似文献
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猪圆环病毒3型(PCV3)是一种在世界范围内分布较广泛的新型猪病毒,其发病机制尚不清楚。为系统分析PCV3 Capsid(Cap)蛋白序列和结构特点,收集Gen Bank登录的来自不同国家和地区的210条PCV3全基因组和Cap蛋白基因序列,筛选获得46株PCV3代表序列;采用生物信息学(Bio Edit和MAGE 6.0等)技术分析PCV3 Cap序列同源性、结构特点、系统进化和热点突变位点情况。结果表明:46株PCV3 Cap序列同源性为97.66%～100%,PCV3 Cap预测的8个B细胞和10个T细胞表位中均存在序列突变,其中B细胞抗原表位E (109～146位氨基酸)和T细胞抗原表位D(72～81位氨基酸)存在的突变位点数最多。研究发现26株属于PCV3a,20株属于PCV3b。PCV3与PCV2 Cap序列比较分析发现,PCV3 Cap在NLS区域内有6处突变(R11K、R12K、H26M、R27K、V31A和R34K); PCV3 Cap序列间比对分析发现,PCV3b Cap序列出现突变的几率(17/20,85%)高于PCV3a (19/26,73%)。而从临床表现有繁殖障碍和死胎的样品中检测出的PCV3序列均存在S77T和I150L突变位点;从伴有发热、肺炎的仔猪以及肺匀浆样本检测出的PCV3序列中均有R10K突变位点,这些特定的突变位点与临床症状的关系需后续深入研究。本研究结果为PCV3基因功能、进化、预防和控制等研究提供重要序列信息。 相似文献
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设计1对针对猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组的特异性引物,从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后构建重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF9特异的限制性内切酶Bpu10Ⅰ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF9基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-J）。用SacⅡ对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应缺失基因DNA（命名为PCV2-J）。用PCV2-J缺失突变株进行细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究。结果显示：PCV2-J转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长;PCV2-J接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV2-J突变病毒的感染;PCV2-J免疫仔猪后的抗体水平在第2周开始上升,与对照组相比差异显著,CD3＋下降,与对照组无差异,CD4＋下降,第1周与对照组差异显著,CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF9基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,但免疫原性减弱。 相似文献
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辽宁地区某猪场发现疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS),经临床症状、病理变化和PCR检测,确诊为猪圆环病毒3型(PCV3)感染;根据Gen Bank中收录的PCV3基因序列,设计2对特异性引物,从患有PMWS的仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长c DNA序列,利用DNAStar和DNAman生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果显示:PCV3毒株基因组全长2 000 bp,命名为CN/Liaoning-2017 (简称LN株)(GenBank登录号:MH177453. 1),基因组有3个开放阅读框(ORF),其中2个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)同源。Cap基因大小为645 bp,编码214个氨基酸。PCV3国内株可分为3大分支(3a簇、3b簇与3c簇),LN株处于3a簇分支中,与湖北株(KY354039. 1)同源性最高,达到99. 7%; LN株与PCV3a簇代表株(PCV3-USMN2016,PCV3-US-MO2015)同源性在98. 8%～99. 2%之间,与PCV3b簇代表株(PCV3-US-SD2016)的同源性为98. 8%,与PCV3c簇代表株(PCV3-China-GD-2016)同源性为98. 7%。Cap蛋白氨基酸位点分析显示,LN株在第68位发生突变,与其他代表株都不相同。以上试验结果表明,成功从患有PMWS的仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析。LN株是辽宁省首次发现的PCV3毒株,这些数据将为研究PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。 相似文献
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为构建携带分子标记的PCV1-2嵌合病毒,本研究通过基因工程技术将V5标签引入PCV2的ORF2末端,以ORF2-V5替换PCV1的ORF2后克隆于pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA-PCV1-2m-V5。为检验pcDNA-PCV1-2m-V5的体外感染性,将其转染PK-15细胞后,采用IPMA、RT-PCR等技术进行检测,结果显示:pcDNA-PCV1-2m-V5具有感染性。采集已注射pcDNA-PCV1-2m-V5质粒的小鼠血清接种于PK-15细胞,应用细胞试验、PCR技术、IFA、western blot及电镜等试验对嵌合病毒进行鉴定。结果显示:在小鼠体内拯救出PCV1-2m-V5嵌合病毒,且V5标签的引入能够很好地区分嵌合病毒和亲本病毒产生的Cap蛋白。本实验可为PCV2的感染性DNA (iDNA)疫苗研发提供素材和参考。 相似文献
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北京地区猪圆环病毒3型感染的检测及基因组遗传变异分析 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在了解北京地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传变异规律,为PCV3的防控提供参考依据。采集北京地区规模化养殖场73份临床表现为繁殖障碍和呼吸系统疾病的组织样品,对其中的PCV3进行检测和测序。根据PCV3全基因组序列设计3对特异性引物,从患PDNS的断奶仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列片段,克隆到pMD19-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长cDNA序列,利用DNAStar和DNAMAN生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果:北京地区PCV3感染率为30.1%(22/73),PCV3全基因组长2 000bp,GenBank序列登录号为MG546667,将该病毒命名为PCV3/CN/BJ-YH2016。其基因组有3个开放阅读框(ORF),其中两个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(replication-associated protein,Rep)和衣壳蛋白(capsid protein,Cap)同源。PCV3/CN/BJ-YH2016与NCBI上30株PCV3基因组序列相似性为98.6%~99.3%,Rep蛋白氨基酸序列与美国毒株PCV3-US/MO2015(KX778720)的相似性最高(为100%),与中国毒株PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016(MF589105)相似性最低(为95%),有16个氨基酸变异,全部集中在5-23位氨基酸。Cap蛋白氨基酸序列与美国毒株2164(KX458235)的相似性为100%,与其他毒株均有1~4个氨基酸发生变异,其中与PCV3-US/MO2015毒株相比变异位点分别位于24、26、56、100aa。以上试验结果表明,成功从患断奶仔猪多系统衰竭综合征仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析,这些数据将为研究这种新型病毒——PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。 相似文献
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为实现携带分子标记的猪圆环病毒2型标记毒株的构建,对其进行感染性DNA(iDNA)疫苗的初步研究,即构建的感染性克隆质粒既能发挥DNA疫苗的作用,同时又能在动物机体内拯救出活病毒,发挥病毒活疫苗的作用,本研究以PCV2Cap蛋白末端具有赖氨酸延伸特征的GZ-RH1株为材料,构建该毒株的感染性克隆质粒pcDNA3.1(+)-PCV2,并在病毒基因组中引入1个SalⅠ酶切位点作为鉴别拯救病毒的分子标记。将该感染性克隆质粒转染PK-15传代细胞进行病毒拯救后,通过IPMA、PCR-RFLP以及全基因组测序等试验对拯救病毒进行检测和鉴定,并初步测定了拯救病毒在体外细胞培养的增殖能力。结果表明,利用构建的感染性克隆质粒拯救获得的PCV2标记毒株,经盲传10代后毒价可到105.3 TCID50/mL,分子标记能够稳定存在,该感染性克隆质粒可以应用到PCV2iDNA疫苗的初步研究中。昆明小鼠接毒试验结果表明,构建的感染性克隆质粒在小鼠体内也具有感染性,能够拯救出PCV2标记毒株,且可以诱导产生抗PCV2的抗体,与体外拯救的标记毒株免疫小鼠具有类似的体内生物学特性,表明PCV2iDNA新型疫苗构建策略是可行的。本研究为进一步研究PCV2iDNA疫苗奠定了基础。 相似文献