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1.
《中国动物传染病学报》2016,(6)
猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)是一种新发现的肠道冠状病毒,可引起仔猪的腹泻。冠状病毒编码的非结构蛋白Nsp5是一种3C样蛋白酶,在病毒多聚前体蛋白加工以及免疫调节中发挥重要作用。本研究以PDCo V CHN-HN-2014株为模板,通过RT-PCR扩增Nsp5基因并将其克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建了重组表达质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明Nsp5可在大肠杆菌中高效、可溶性表达。采用镍亲和层析对表达的Nsp5蛋白进行纯化,并通过荧光共振能量转移方法检测了其蛋白酶活性,结果表明纯化的Nsp5蛋白能够有效切割含有PDCo V Nsp5氨基端自切割位点的十二肽底物,证实体外表达的Nsp5重组蛋白具有良好的蛋白酶切割活性。猪δ冠状病毒Nsp5蛋白的克隆、表达及其蛋白酶活性检测,为深入研究该蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
2.
猪流行性腹泻病毒(PEDV)的非结构蛋白Nsp6在诱导宿主细胞自噬中起着重要作用。为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域,本研究利用RT-PCR扩增技术获得了Nsp6及其3个分段基因。首先构建了重组原核表达质粒pSUMO-Nsp6,并转化至大肠杆菌Rosetta感受态中,经IPTG诱导并纯化后,所得蛋白用于小鼠免疫,制备抗Nsp6蛋白的多克隆抗体。再将Nsp6及其3个分段基因分别构建至真核表达载体pCMV-HA,并将其转染至IPEC-J2细胞进行真核表达,通过Western blot和双荧光标记法来确定蛋白表达情况。结果：Nsp6蛋白在Rosetta中成功表达,并通过免疫小鼠获得了效价为1∶10 240的多克隆抗体,该抗体具有与PEDV和Nsp6蛋白特异性结合的能力;免疫荧光及Western blot结果表明,Nsp-6及其截短基因在IPEC-J2细胞中成功表达,且与制备的Nsp6多克隆抗体发生特异性结合。综上,本研究原核表达了Nsp6蛋白并制备了相应的特异性抗体,验证了Nsp6及其分段基因的在细胞中的真核表达,为进一步研究Nsp6蛋白的特性和功能奠定了基础。 相似文献
3.
【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a; LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 ... 相似文献
4.
《畜牧与兽医》2017,(11):87-91
为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白7(Nsp7)的结构特征和免疫原性,本研究通过生物信息学分析Nsp7蛋白序列特征及空间结构,在此基础上对Nsp7进行原核表达和纯化,并制备抗Nsp7多克隆抗体。结果显示,Nsp7基因在PEDV不同毒株间高度保守,Nsp7蛋白的三级结构主要由4个α螺旋片组成。SDS-PAGE试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,重组蛋白大小为9.2 ku,经纯化后得到单一条带。采用纯化的Nsp7免疫兔制备多克隆抗体,然后经Western blot和间接免疫荧光试验鉴定,多克隆抗体能够特异性识别重组Nsp7蛋白和PEDV感染细胞的Nsp7蛋白,证明Nsp7免疫原性良好,为后续研究Nsp7的功能及研制以Nsp7为检测靶标的PEDV诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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6.
家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测 总被引：1，自引：0，他引：1
Cecropin-XJ是一种从家蚕幼虫体内分离纯化的具有很强热稳定性、酸碱适应性和广谱抗菌性的新型家蚕抗菌肽。以融合不同标签的表达载体构建pET28a-Cecropin-XJ、pET30a-Cecropin-XJ、pET32a-Cecropin-XJ、pMAL-p2X-Cecropin-XJ重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度等条件,通过对目的蛋白表达的检测分析,选择、建立Cecropin-XJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的技术体系。试验结果表明:采用构建的重组原核表达载体pET32a-Cecropin-XJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达产物形式存在,可溶性蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的Cecropin-XJ融合蛋白纯度可达90%以上。体外抑菌试验显示Cecropin-XJ融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。 相似文献
7.
《动物医学进展》2021,42(6)
为表达具有活性的N-豆蔻酰基转移酶(N-myristoyltransferase, NMT),用于口蹄疫病毒样颗粒组装效率的优化,将hNMT1基因克隆至pRSFDuet1表达载体,将其转化至大肠埃希氏菌BL21-CodenPlus(DE3)-RIL中,经IPTG诱导,并对诱导前细菌浓度、诱导剂浓度、诱导温度进行优化。目标蛋白经Ni~(2+)亲和层析纯化后进行免疫印迹验证,荧光法测定其活性。结果显示,成功表达出hNMT1,在OD 600 nm值为1.0、IPTG浓度为0.5 mmol/L、表达温度为16℃时,hNMT1蛋白可溶性表达量最高,镍柱纯化后蛋白与抗His标签单克隆抗体在46 ku处特异性结合,与预测大小一致。确定了hNMT1表达的最适条件并成功制备出具有催化豆蔻酰化活性的hNMT1,为研究豆蔻酰化修饰对小RNA病毒蛋白衣壳装配的影响奠定了基础。 相似文献
8.
为探讨肠炎沙门菌非编码小RNA(non-coding small RNA)IsrE在转录后水平是否参与对fimA的调控作用,在大肠杆菌中构建并表达FimA重组蛋白,并对其培养条件进行优化,制备高纯度FimA重组蛋白。利用原核表达载体p ET-28a(+)构建出能表达fimA的重组质粒,并分别对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间等条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和增大其可溶性,最后经Ni-NTA亲和层析分离纯化FimA重组蛋白。通过酶切、测序和Western blot鉴定分析,成功构建并表达肠炎沙门菌I型菌毛主要亚单位FimA,蛋白分子质量约为19.3 kDa,且主要以包涵体的形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE中显示单一条带。本研究构建、表达并获得纯度较高的重组蛋白FimA,为进一步研究和验证肠炎沙门菌非编码sRNA IsrE是否在转录后水平参与对fimA的调控奠定了基础。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2021,(5)
猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。 相似文献
10.
为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(23)
为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的优势抗原表位COE可溶性原核表达及其反应原性,试验采用RT-PCR方法扩增出COE基因,将其克隆至原核表达载体p MAL-C5X上,构建重组质粒p MAL-C5X-COE,经测序鉴定正确后转化Rosetta感受态细胞,并进行IPTG诱导表达和Westernblot验证。结果表明:重组菌p MAL-C5X-COE表达的融合蛋白MBP-COE的分子质量约为57 ku,优化的诱导条件为IPTG浓度0.8 mmol/L、诱导时间4 h,诱导温度30℃,重组蛋白以可溶性蛋白形式存在于菌体中,融合蛋白与兔抗PEDV多克隆抗血清发生特异的免疫印迹反应。说明原核表达的COE融合蛋白可溶且具有良好的反应原性。 相似文献
13.
【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和Hind Ⅲ双酶切的线性化pET-32a (+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D600 nm值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37 ℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度＞95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×104U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。 相似文献
14.
以本实验室构建的鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减杂交文库(SSH)为基础,对家蝇幼虫溶菌酶II基因(MdL-II)进行克隆,得到全长为532 bp的cDNA片段,其开放阅读框(ORF)与GenBank中登录号为HQ897688.1的MdL-II基因全序列同源性为95%。将MdL-II ORF序列插入到pET-32a(+)表达载体中成功构建重组质粒,其表达产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,结果显示约在34 ku处出现表达条带且与目的蛋白大小相符。当诱导温度为37℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L时可获得大量可溶性Trx-MdL-II融合蛋白,纯化融合蛋白并进一步检测该蛋白的抑菌活性,结果表明融合蛋白对大肠杆菌和链球菌均有抑菌作用,且对大肠杆菌的抑菌作用相对较强。 相似文献
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为探讨不同原核表达载体、不同表达温度对重组表达Eimeria tenella丙二酸单酰辅酶A:ACP转移酶活性的影响,以生物信息学技术预测的E.tenellaⅡ型脂肪酸合成代谢途径中的丙二酰单酰辅酶A:ACP转移酶(Et-MCAT)编码序列为基础,分别设计引物扩增完整ORF,采取截除信号肽而保留转导肽以及切除信号肽和转导肽的不同策略,选择pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa3种不同表达载体分别构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)后,在不同条件下诱导表达,利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性,以评价不同表达策略对表达效果和表达产物活性的影响。表达水平和酶活性分析结果显示,惟切除信号肽和转导肽后的功能蛋白编码区能表达,Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mcat体系的可溶性表达量高于Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-mcat,但二者表达产物的酶活性相似,且均随着诱导温度的降低其可溶性蛋白表达量增加。但Rosseta(DE3)/pProExHTa-mcat体系仅能表达不溶性蛋白,且复性后无酶活性,改变诱导温度对表达效果无明显影响。结果表明不同表达载体和诱导温度对大肠杆菌所表达EtMCAT的活性及其表达形式有显著影响,其中融合标签和表达温度可能是主要的影响因素,包涵体表达的重组酶即使复性处理仍难达到酶活性分析的要求。 相似文献
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《蚕业科学》2017,(2)
柞蚕传染性软腐病病毒是从感染吐白水软化病的柞蚕体内分离的一株小RNA病毒,属于软腐病病毒属(Iflavirus),含解旋酶结构域的2C蛋白是该病毒的功能蛋白质之一。以感染柞蚕软腐病病毒的柞蚕蛹c DNA为模板,PCR获得2C蛋白的编码基因,并利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆粒p Fast Bac-Dual-GFP-Hel 2C,在昆虫细胞Sf9中表达了该病毒的2C蛋白。对重组2C蛋白的三磷酸核苷水解酶(NTPase)活性和解旋酶活性进行检测的结果显示:重组2C蛋白具有NTPase活性,能够水解4种NTP,并且具有解旋酶活性,能够解旋3'端至5'端方向单链突出的双链DNA。初步推测2C蛋白在柞蚕传染性软腐病病毒复制中发挥水解三磷酸核苷和解旋DNA链的作用。 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(11)
反转录酶是动物RNA病毒分子诊断用到的关键试剂之一。为获得纯度高、活性高、制备简单经济的M-MLV RTase,本试验将M-MLV RTase的基因序列进行密码子优化,合成并构建表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌E.coli Rosetta宿主菌种,经IPTG诱导后实现M-MLV RTase的可溶性表达。利用Ni2+柱亲和层析纯化载有6x His标记的重组MMLV RTase,对重组酶进行Western Blotting试验,鉴定为M-MLV RTase。通过对动物流感病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测来评价重组酶的活性并估测其活性单位。将活性单位相当的重组酶和商品酶进行比较,结果显示,制备的重组酶活性高,对不同浓度病毒RNA的检测结果与商品酶相当。研制的M-MLV RTase可以用于动物RNA病毒的分子诊断。 相似文献
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【目的】建立一种猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的IgA抗体ELISA检测方法。【方法】以PEDV流行株CH/HNPJ/2017(MF152604.1)为生物材料,通过RT-PCR扩增出S2基因(2 368—4 170 bp),并将其插入到原核表达载体pET-24a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,经镍柱纯化。Western blotting验证重组蛋白S2与PEDV阳性血清的反应原性和特异性。将其作为包被抗原,建立一种基于PEDV变异毒株重组全长S2蛋白的IgA抗体ELISA方法,用棋盘法确定该方法的最优检测条件,对其敏感性、特异性和重复性进行测定,并初步应用于130份猪血清和40份猪口腔黏液的检测。【结果】通过RT-PCR方法扩增出S2基因,成功构建重组表达载体pET-24a-S2,转化大肠杆菌经诱导表达纯化后获得重组S2蛋白。SDS-PAGE结果显示,纯化的S2蛋白条带特异且无杂带;Western blotting试验表明该蛋白与PEDV阳性猪血清具有良好的反应性。ELISA方法反应条... 相似文献
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本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献
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根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。 相似文献