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《畜牧兽医学报》2020,(8)
旨在探究缺失、小的、同源异形1(absent, small, or homeotic 1-like,ASH1L)甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能。本研究通过免疫荧光染色在健康母牛卵丘细胞中对ASH1L甲基转移酶进行定位,并分析细胞的组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine36, H3K36)甲基化修饰模式;合成靶向Ash1L基因的siRNA,对siRNA-1、 siRNA-2、siRNA-3及对照组进行荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹,筛选有效siRNA;采用荧光定量PCR分析干扰Ash1L表达对处理组及对照组中凋亡相关基因及多梳抑制复合体(polycomb repressive complex 2, PRC2)组成基因的表达水平的影响。结果显示,ASH1L甲基转移酶位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2,其干扰效率为60%～70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36的单甲基化、二甲基化及三甲基化3种甲基化水平均显著低于对照组(P0.05);干扰Ash1L导致凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146);同时,干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基EZH2和Suz12基因的mRNA表达量显著升高(P0.05)。综上所述,本研究探讨了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达和功能,ASH1L在牛卵丘细胞中呈点状分布,且Ash1L基因的抑制导致H3K36me1/2/3水平均显著下降及凋亡基因和PRC2蛋白相关亚基EZH2和Suz12基因表达的升高,为进一步研究其对家畜胚胎的调控作用提供技术和理论基础。 相似文献
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试验旨在研究体外培养液中添加灭多威（methomyl，MET）对牛卵母细胞质量的影响。通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR等方法检测牛卵母细胞的卵丘细胞扩展程度、第一极体排出率、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、线粒体膜电位（ΔΨm）以及凋亡相关基因的表达进行评价。结果显示，不同浓度MET不影响卵丘细胞的扩展程度，但200 μmol/L MET处理组卵母细胞的第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。与对照组相比，200 μmol/L MET处理组的卵母细胞ROS水平显著升高，GSH水平、线粒体膜电位（ΔΨm）均显著降低（P<0.05）。此外，本研究还发现，200 μmol/L MET处理组卵母细胞中促凋亡基因Caspase-3和Bax的mRNA转录水平显著升高，抗凋亡基因Bcl-xl的mRNA转录水平显著降低（P<0.05）。上述结果表明，MET可以通过增加氧化应激和细胞凋亡来降低体外培养牛卵母细胞的质量。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(5):880-884
本试验利用RNAi方法抑制牛卵丘细胞中JARID2基因mRNA的表达水平,通过免疫荧光方法检测H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3的甲基化程度。结果表明,在牛卵丘细胞中存在JARID2的表达,并且存在H3K9me3、H3K27me3的甲基化修饰,但没有检测到H3K4me3、H3K36me3的甲基化修饰。通过siRNA对牛卵丘细胞中JARID2 mRNA的表达进行成功抑制后,转染组JARID2的表达量明显下降,但H3K4me3、H3K27me3表达量无明显变化,而H3K9me3、H3K27me3表达量明显下降,即JARID2在mRNA水平上能够影响H3K9me3、H3K27me3的甲基化修饰程度,而对H3K4me3、H3K36me3的甲基化修饰无明显作用。 相似文献
5.
旨在探究5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC）对牛成肌细胞的增殖和肌分化因子（myogenic differentiation 1,MyoD1）启动子甲基化以及mRNA表达的影响。本研究复苏了前期冻存的关岭牛成肌细胞,并进行培养,待其生长到对数生长期,再通过不同浓度的5-Aza-dC对牛成肌细胞进行处理,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期;结合高通量检测方法检测MyoD1启动子甲基化水平,并利用qRT-PCR检测MyoD1及相关基因的表达水平。研究发现,0.1 μmol·L-15-Aza-dC为最适浓度,该浓度下细胞抗凋亡因子Bcl的表达极显著降低（P<0.01）,促凋亡因子Bax的表达极显著提高（P<0.01）,促凋亡因子Caspase-9的表达显著提高（P<0.05）;周期因子Cyclin A2的表达显著提高（P<0.05）,而细胞因子Cyclin B1、Cyclin D的表达无显著变化;检测空白组和试验组MyoD1启动子甲基化水平发现,试验组甲基化水平极显著低于空白组（P<0.01）;而mRNA的表达水平极显著高于空白组（P<0.01）。5-Aza-dC能够通过改变Caspase-9、Bcl、Bax、Cyclin A2等基因的表达来调节关岭牛成肌细胞的增殖和凋亡,并能够有效降低MyoD1基因启动子的甲基化水平（P<0.01）;极显著提高其mRNA的表达量（P<0.01）。低浓度的5-Aza-dC能通过促进细胞凋亡及调控关岭牛MyoD1的甲基化水平来调控MyoD1的表达;同时推测,MyoD1基因启动子的甲基化水平能够影响关岭牛成肌细胞的生长发育,可为遗传标记辅助关岭牛的改良提供理论参考。 相似文献
6.
[目的] 研究白藜芦醇（resveratrol,RES）对水牛卵丘细胞体外培养过程中细胞增殖活力、激素分泌、卵丘扩展及抗凋亡和抗氧化能力的影响。[方法] 用不同浓度（0（对照组）、1、10、20、30、40、50和60 μmol/L）RES培养卵丘细胞,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力,筛选最佳RES处理浓度及时间用于后续试验。用ELISA法测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇（estradiol,E2）和孕酮（progesterone,P4）的含量,实时荧光定量PCR法测定卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因的相对表达量。[结果] 与对照组相比,在体外培养24~36 h内,1、10和20 μmol/L RES组水牛卵丘细胞的增殖活力均有升高趋势,10 μmol/L RES处理36 h细胞活力最强,因此用于后续试验中细胞的处理。体外培养36 h时,10 μmol/L RES组细胞增殖能力和E2、P4的分泌显著增加（P<0.05）;10 μmol/L RES组卵丘细胞扩展相关基因穿透素3（PTX3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）基因mRNA相对表达量显著或极显著增加（P<0.05;P<0.01）,而促凋亡基因Bcl-2相关蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和p21的表达量显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）,透明质酸合酶2（HAS2）和过氧化氢酶（CAT）的表达量无显著差异（P>0.05）。[结论] 培养液中添加10 μmol/L RES能够提高水牛卵丘细胞体外培养的增殖活力,促进卵丘细胞激素分泌和卵丘细胞扩展,并增强卵丘细胞抗氧化能力并减少细胞凋亡。 相似文献
7.
旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。 相似文献
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本文旨在研究DNA甲基转移酶抑制剂S-腺苷高半胱氨酸（SAH）对猪成纤维细胞体外增殖活力、周期、凋亡和DNA甲基化水平的影响，为SAH在猪体细胞核移植上的应用提供理论基础。使用不同浓度的SAH(0、0.01、0.1、0.5、1mmol/L)处理猪成纤维细胞，通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期与凋亡，ELISA检测DNA甲基化水平，qRT-PCR检测相关基因表达情况。结果表明：与其余各组相比，0.1mmol/LSAH处理猪成纤维细胞24h对细胞活力和凋亡无明显影响，但可将细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.05）；与对照组相比，0.1 mmol/L SAH处理24 h可显著降低细胞中DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶相关基因DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，同时，显著提高细胞周期调控基因P21、P27的表达，但对凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达无明显影响。总的来说，0.1 mmol/L SAH处理24 h效果优于其他组，对细胞损伤较小，可通过影响DNA甲基转移酶相关基因表达来参与调控DNA甲基化水平。 相似文献
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旨在克隆山羊SERBP1基因,揭示干扰SERBP1基因后对山羊鼻甲骨原代细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的作用,为进一步研究羊口疮病毒诱导细胞凋亡的分子机制奠定基础。本研究以简州大耳羊为试验动物,利用RT-PCR技术克隆SERBP1基因cDNA序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测SERBP1基因在不同组织的表达水平;并筛选有效干扰序列;MTT法检测siRNA干扰SERBP1对山羊鼻甲骨原代细胞增殖的影响,流式细胞仪检测siRNA干扰SERBP1对细胞周期和凋亡的影响,RT-qPCR检测对凋亡相关基因P53、Caspase7、Caspase3等的影响。成功扩增山羊SERBP1基因1 293 bp,包含5'UTR 44 bp,CDS区1 179 bp,3'UTR 70 bp,编码392个氨基酸残基,不存在信号肽,主要定位于细胞核;预测到SERBP1可能与RPL31、RPS3等10个蛋白存在相互作用。SERBP1基因在山羊胰腺中表达水平最高;筛选到干扰效率为70%的有效干扰序列;siRNA干扰SERBP1基因后抑制了山羊鼻甲骨原代细胞增殖和凋亡,且细胞被阻滞于G0/G1期;同时可下调Caspase3、Caspase7、BCL2L11和Bax基因mRNA的表达,而对Bcl-2、P53、PARP1基因mRNA的表达无显著影响。干扰山羊SERBP1基因抑制了山羊鼻甲骨原代细胞增殖和凋亡,并诱导细胞周期停滞。研究结果为进一步深入研究SERBP1基因功能,揭示ORFV125抑制细胞凋亡的分子机制提供重要的试验数据。 相似文献
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试验旨在研究RNA m6A修饰相关基因去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5，ALKBH5）、去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP）在鸡骨骼肌发育过程中的表达，分析其与骨骼肌m6A甲基化水平的相关性。首先，利用实时荧光定量PCR技术检测m6A甲基化相关基因在金茅花鸡12（E12）、14（E14）、16（E16）、18（E18）胚龄和1日龄腿肌和胸肌组织中mRNA表达水平，以及其在鸡成肌细胞50%、100%增殖期和1、2、3、4、5 d分化期的mRNA表达水平；随后，利用m6A甲基化试剂盒检测金茅花鸡E12和1日龄腿肌和胸肌组织中m6A甲基化修饰水平，与m6A甲基化相关基因表达水平进行相关性分析。结果显示，m6A去甲基化基因ALKBH5和FTO mRNA表达水平在骨骼肌发育过程中显著上调（P<0.05），即在E12、E14低表达，E16、E18逐渐上调，1日龄达到最高。m6A甲基化写入基因METTL14、METTL3和WTAP mRNA表达水平在E12、E14、E16逐渐上升，E18下降，随后至1日龄表达量回升。在细胞增殖过程中，ALKBH5、FTO、METTL14、METTL3和WTAP基因表达均上调；在细胞分化过程中ALKBH5和FTO基因表达水平显著上调（P<0.05），在分化第5天达到最高。METTL14、METTL3和WTAP基因mRNA表达水平在细胞诱导分化的1、2、3、4 d表达量呈下降趋势，而在诱导分化的第5天有所回升。甲基化水平检测结果显示，腿肌和胸肌m6A甲基化水平变化趋势一致，均在胚胎发育过程中显著下降（P<0.05），至1日龄达到最低。相关性分析结果显示，鸡骨骼肌RNA m6A甲基化水平与m6A去甲基化修饰基因ALKBH5、FTO mRNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。综合以上试验结果，推测m6A甲基化修饰与鸡骨骼肌发育相关，而去甲基化基因ALKBH5、FTO可能通过调控RNA m6A甲基化水平，影响鸡骨骼肌发育。本研究结果为进一步研究m6A甲基化修饰调控鸡骨骼肌生长发育的功能和分子机制提供理论依据。 相似文献
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为探讨核因子E2相关因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf2）基因沉默及激活后对牛子宫内膜上皮细胞的影响，本试验利用小分子干扰（siRNA）技术及Nrf2的激动剂叔丁基对苯二酚（tBHQ），分别从Nrf2基因的下调和上调表达来研究Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞中血红素加氧酶-1（HO-1）和Homebox A10（HOXA10）基因表达的影响。结果显示，经实时荧光定量PCR方法检测，在设计的2条siRNA序列（siRNA-1209和siRNA-1672）中，siRNA-1672在终浓度为75 nmol/L、作用时间24 h时抑制效果较好，抑制效率在80%以上；经Western blotting方法检测，Nrf2蛋白表达水平在转染后96 h极显著下降（P<0.01），而HO-1和HOXA10的mRNA表达量分别下降了60%和70%（P<0.01），蛋白表达量在96 h后极显著或显著下降（P<0.01；P<0.05）。此外，经CCK8方法检测，Nrf2基因表达沉默后，牛子宫内膜上皮细胞增殖能力减弱。而在tBHQ激活Nrf2试验中，经Western blotting方法检测，tBHQ终浓度为30 μmol/L时Nrf2蛋白表达量最高，极显著高于对照组（P<0.01），且HO-1和HOXA10的蛋白表达量与对照组相比也明显上升。结果表明，本试验设计的siRNA-1672能特异性地抑制牛子宫内膜上皮细胞Nrf2的表达，而抑制Nrf2的表达会导致牛子宫内膜上皮细胞增殖能力下降，且Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞HO-1和HOXA10基因表达存在调控作用。 相似文献
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旨在分析Hippo信号通路的效应基因YAP1在不同繁殖力湖羊子宫内膜中的表达模式及功能。本研究根据系谱档案和BMPR-1B基因多态性分析，将9只体况相近且健康的经产母羊分为3组(HBB、LBB以及LB+,n=3)。提取不同繁殖力湖羊子宫内膜组织RNA,并反转录为cDNA,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析Hippo信号通路中几个主效基因的表达模式。运用生物信息学方法分析YAP1在不同物种间的氨基酸同源性及其亲缘关系。体外分离湖羊子宫内膜基质细胞，利用RNA干扰和细胞转染技术体外干扰YAP1,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析YAP1基因对子宫容受性相关基因的影响。利用流式细胞术分析干扰YAP1对细胞凋亡的影响，同时利用RT-qPCR和Western blot检测干扰YAP1后凋亡及线粒体相关基因的表达。结果显示，Hippo信号通路中YAP1、LATS1、MST1基因在不同繁殖力湖羊子宫内膜组织中的表达水平存在差异，其中YAP1基因在高繁殖力(HBB)湖羊子宫内膜中的表达量显著高于两组低繁殖力(LB+、LBB)湖羊；氨基酸同源性及系统进化树分析显示，绵羊YAP1蛋白与... 相似文献
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旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMP response element binding protein）基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明：1）克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区（GenBank登录号：MK158073）,并对其进行生物信息学分析。2）该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍（P<0.05）。3）成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%（P<0.01）;并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量（P<0.05）,并显著增加了HSL基因表达量（P<0.05）;且细胞内甘油三酯含量被显著下调（P<0.05）。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。 相似文献
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旨在探究玉米赤霉烯酮(ZEA)对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的毒性作用机制,采用MTT法检测细胞活力变化,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活力,ELISA法检测Caspase-3含量,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,荧光显微镜观察细胞活性氧(ROS)水平,线粒体膜电位变化,RT-qPCR法检测内质网应激(ERs)和细胞凋亡相关基因的mRNA转录水平。结果显示,12.5~50.0 μg·mL-1 ZEA显著抑制DF-1细胞增殖(P<0.01),且呈时间和剂量依赖性关系。25.0 μg·mL-1 ZEA处理细胞24 h后,上清液中LDH和Caspase-3含量显著升高(P<0.01);细胞中ROS水平和细胞凋亡数量极显著升高(P<0.01);线粒体膜电位极显著降低(P<0.01)。凋亡相关基因Caspase-3、Bax mRNA转录水平极显著上调(P<0.01),Bcl-2 mRNA转录水平极显著下调(P<0.01);ERs相关基因GRP78、ATF6、ATF4、CHOP、PERK mRNA转录水平极显著上调(P<0.01)。综上表明,ZEA能通过内质网应激途径导致细胞凋亡并对鸡胚成纤维细胞发挥毒性作用。研究结果为深入研究ZEA对鸡细胞的毒性作用和解毒手段奠定基础,对相关禽类疾病治疗具有意义。 相似文献
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LI Rui-lan OUYANG Xiao-qing ZHANG Chun-qiang ZHANG Tong FAN Xiao-mei ZHANG Jia-xin 《中国畜牧兽医》2015,42(6):1325-1332
The objective of the study was to construct the eukaryotic expression vector of bovine GDF-9 gene,and investigate its effect on the expression of expansion-related genes in transfected bovine cumulus cells.Eukaryotic expression vector plasmid pcDNA4 myc-his-GDF-9 was constructed by insert GDF-9 in the multiple cloning site.pcDNA4 myc-his-GDF-9 was transfected into bovine cumulus cells by liposome.The expression of GDF-9 gene was detected by Western blotting and the expression of the expansion-related genes in bovine cumulus cells was detected by qRT-PCR.The results showed that GDF-9 could express in transfected bovine cumulus cells and the expression of expansion-related genes PTGS2,PTX3 and HAS2 in transfected bovine cumulus cells were significantly increased (P< 0.05).In a conclusion,the bovine pcDNA4 myc-his-GDF-9 could effectively transfected into bovine cumulus cells,which could help to study farther functions of the GDF-9 gene. 相似文献