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猪圆环病毒(PCV)是一种单股、环状DNA病毒,有两种血清型,其中PCV-2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的重要病原,给世界养猪业造成了巨大的经济损失.文章主要从PCV-1和PCV-2的基因组结构、复制起始区的结构与功能、复制相关蛋白的结构与功能、转录图谱、各转录物的剪接方式及主要转录物的转录效率等方面进行了综述,同时也对二者的复制与转录模式的异同点进行了比较.这些结果对PCV-1和PCV-2毒力差异的分子机制研究具有一定的借鉴意义,同时可为抗PCV药物的研发提供一定的理论依据. 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果：将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。 相似文献
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旨在筛选PK-15细胞中与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制起始区(origin of replication, Ori)互作的细胞蛋白谱,并初步探究PARP1蛋白对PCV2复制的调控。利用DNA-protein pull down结合LC-MS/MS方法筛选PCV2复制起始区DNA互作蛋白;对互作蛋白进行GO分析以及KEGG通路富集分析,并绘制蛋白互作网络图。在对互作蛋白进行分析的基础上,选择聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)蛋白,开展了深入研究。构建了PARP1蛋白以及PCV2复制蛋白Rep真核表达质粒,并利用DNA-protein pull down及DNA IP试验验证PARP1蛋白与PCV2 Ori的互作;通过Co-IP试验,研究了PARP1蛋白与PCV2 Rep蛋白的互作;在细胞中过表达或沉默PARP1蛋白,通过qPCR方法检测对PCV2复制的影响。本研究共鉴定到130种可能与Ori互作的宿主蛋白,其中,与DNA功能相关的蛋白共有45种,主要涉及宿主DNA损伤修复及DNA复制功能;验证了PARP1蛋白与PCV2基因组Or... 相似文献
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N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。 相似文献
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<正>上期回顾:上期主要介绍猪圆环病毒基因组的组成和分类(猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型)。1.4来源和进化对植物萎缩病毒和动物圆环病毒的rep基因序列分析发现,植物萎缩病毒和哺乳动物RNA病毒在哺乳动物宿主体内发生过重组,产生了PCV具有功能性的rep基因。因此PCV最初可能从植物萎缩病毒逐步进化,通过宿主转移机制进入哺乳动物、然后与小核糖核酸病毒重组后产生的[36]。细菌中的PCV的DNA不需要Rep’蛋白就能滚环复制,而在哺乳动物细胞中Rep’蛋白是PCV复制必须的[37]。这说明PCVs、植物复染色体病毒和萎缩病毒可能是从原核生 相似文献
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猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒病相关疾病的主要致病原,可损伤宿主的免疫系统,加剧一些细菌病和病毒病感染的临床症状,在全球养猪业中造成巨大损失。PCV2的基因组DNA含有11个开放阅读框(ORFs),其中至少有7个ORFs编码的蛋白质分子质量大于5ku,但目前只有5种编码的蛋白(Rep、Rep'、Cap、ORF3和ORF4)发现于PCV2复制过程中。作者概述了当前PCV2基因组DNA的结构与功能,阐明PCV2的病原学,为防控PCV2感染提供科学依据。 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORFl和ORF2基因的克隆与表达 总被引：5，自引：4，他引：5
猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。 相似文献
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猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立与评价 总被引：1，自引：0，他引：1
根据猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep和Cap基因保守区设计2对引物,1对外引物和1对内引物;利用设计的4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对PCV2 DNA进行恒温扩增;扩增条件为63℃恒温反应1h;建立了PCV2环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对检测方法特异性评价表明,检测方法只能检测PCV2 DNA,对猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)及猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)检测无交叉反应。灵敏度评价表明,该检测方法可以检测到样品中10个拷贝的PCV2 DNA含量。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性 总被引：3，自引：1，他引：3
为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。 相似文献
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猪圆环病毒3型(PCV3)作为一种新发现的圆环病毒,对养猪业的威胁持续升级。PCV3属于圆环病毒科、圆环病毒属,是一种无囊膜的环状DNA病毒。PCV3基因组由编码复制酶蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)的2个ORFs组成。其中,Cap蛋白在诱导宿主特异性免疫应答过程中发挥重要作用。2015年,美国学者Palinski等在患有猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次分离鉴定了PCV3。随后,中国、巴西、意大利、韩国、泰国、西班牙、丹麦、德国、瑞典和波兰等国家,陆续报道了PCV3感染病例。 相似文献
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为制备猪圆环病毒2型Rep’蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep’蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep’和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep’蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep’蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep’蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。 相似文献
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猪宿主蛋白G3BP1在宿主抵抗病毒感染过程中起着重要作用,然而还未有相关报道G3BP1与猪圆环病毒2型(PCV2)感染过程中的联系。本文构建了G3BP1真核表达载体和干扰RNA,实现在PK15细胞上G3BP1的过表达及敲低。结果发现,PCV2感染细胞24 h后病毒复制出现显著差异,感染48 h相比于感染24 h病毒复制差异更显著,表明G3BP1能显著促进PCV2复制。过表达或敲低G3BP1后,用干扰素刺激DNA(ISD)刺激12 h,G3BP1能促进ISD诱导IFN-βmRNA的表达;感染PCV212 h后,G3BP1也能正调控IFN-βmRNA的转录。本文揭示了宿主蛋白G3BP1显著促进PCV2的复制,很可能是通过上调IFN-β表达引起的。 相似文献
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为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化.采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法.结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1h和30 min.该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4％,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测. 相似文献
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猪圆环病毒诊断技术研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于单股DNA圆环病毒科(Circoviridae),该科的共同特征为20面体对称,无囊膜,核酸为负链,单股环状DNA,是迄今为止发现的最小的动物病毒。PCV在宿主细胞内的复制模式可能 相似文献
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猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达 总被引：3，自引：1，他引：3
猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础. 相似文献
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猪圆环病毒基因组结构及其分子特征研究进展 总被引：3，自引：1，他引：2
目前,国际上已分离获得2个不同血清型的猪圆环病毒（PCV）,并命名为猪圆环病毒1型（PCV-1）和猪圆环病毒2型（PCV-2）。PCV-1对猪无致病性,而PCV-2被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PCV基因组为单股环状双向DNA,由2个头一头相对排列的开放性阅读框和基因间隔区组成,包含rep基因、cap基因及病毒DNA复制起始区茎环序列。rep基因编码2种不同的复制酶相关蛋白,cap基因编码病毒结构蛋白或衣壳蛋白,茎环序列在病毒蛋白合成、DNA自身复制及子代病毒产生中发挥重要作用。PCV-2衣壳蛋白110位（P→A）和191位（R→S）氨基酸突变,提高PCV-2在体外组织培养中的增殖效率,而减弱其对动物的致病性和毒力。 相似文献
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为提高猪圆环病毒(PCV)的滴度,以本实验室已成功分离的1株PCV2d流行毒株PCV2RC160307为模板,通过融合PCR突变其Rep蛋白上的1个N-糖基化位点,并成功构建自身环化感染性克隆HT-PCV2,转染ST细胞,盲传至F8代后,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)及过氧化物酶单层试验(IMPA)进行验证,并通过IMPA测定TCID50发现,拯救成功的HT-PCV2病毒滴度为105.2×TCID50/0.1mL,较分离的流行毒株RC160307及未糖基化位点突变的感染性克隆H-PCV2的病毒滴度有所提高。此种方法为PCV2复制机制的进一步研究疫苗的研制及其疾病的预防奠定基础。 相似文献