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1.
为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blotting检测抗血清特异性。OPN序列的同源性比对分析发现,在不同进化层次动物中均存在Arg-Gly-Asp(RGD)短肽重复序列;OPN序列系统进化分析显示,OPN在动物间具有明显的进化趋势;提取小鼠肝脏RNA,OPN重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果及蛋白表达、纯化条带大小均与预测一致;ELISA法确认OPN抗血清滴度达1:1 600;Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。结果表明本试验对OPN序列进行了遗传进化分析,成功克隆、表达、纯化及复性OPN蛋白,并制备、鉴定了小鼠多克隆抗体。 相似文献
2.
福氏志贺菌外膜蛋白A是细菌入侵宿主细胞的作用蛋白,同时激活机体的免疫机制对抗细菌的感染,在动物疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆方法获得福氏志贺菌OmpA蛋白表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OmpA蛋白,免疫小鼠制备OmpA蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Western blot检测抗血清特异性;DNAMan与MEGA软件分析OmpA蛋白系统进化关系。结果显示,OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致;ELISA法确认OmpA抗血清滴度达1∶1 600,Western blot证实抗血清具有很好的特异性。OmpA序列系统发生分析发现不同种的致病菌存在同源性,尤其C-端同源性较高,并且不同种志贺菌具有更高的同源性。表明成功制备OmpA蛋白和小鼠多克隆抗体,为OmpA蛋白功能与疫苗开发研究奠定了基础。 相似文献
3.
【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。 相似文献
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试验旨在获得高纯度犬降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1：51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2019,(12)
本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
7.
《中国畜牧兽医》2020,(3)
试验旨在获得高纯度犬降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a(+),未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1∶51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。 相似文献
8.
为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理. 相似文献
9.
YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein,YTHDF2)作为一种m~6A修饰的结合蛋白,可对底物mRNA的剪接,翻译,降解等过程进行调控。本研究通过RT-PCR首次获得了猪YTHDF2编码基因序列,全长1 743 bp,编码580个氨基酸,基因进化树分析显示该基因在各物种间保守性较高。将猪YTHDF2编码基因克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,重组质粒pET-28a (+)-YTHDF2在大肠杆菌BL-21菌株中进行原核表达,成功获得了大量带His标签的猪YTHDH2重组蛋白,大小约70 kD。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备猪YTHDF2多抗血清,ELISA结果表明制备的兔抗猪YTHDF2多抗血清效价为1:204 800,间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验均表明该多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。猪YTHDF2基因序列的获得及多克隆抗体的制备为进一步研究YTHDF2在猪mRNA m~6A甲基化过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝... 相似文献
11.
本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体。使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列（登录号：NM_001105040.1）设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a （+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7。将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定。通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达。生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力。PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1∶128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β（IFN-β）的表达（P<0.05）。综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料。 相似文献
12.
将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IP TG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95％;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。 相似文献
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为获得一种针对不同亚型流感病毒的共同保护性抗原,本研究以H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的主要抗原蛋白血凝素(HA)为靶标,以四甘氨酸接头肽替换HA头部结构域,将免疫反应定向至更保守的HA茎部区,同时在HA茎部添加T4折叠三聚体以保护蛋白天然构象,通过杆状病毒表达系统表达头部缺失HA蛋白,并验证其抗原性。结果表明,利用昆虫细胞表达的头部缺失,HA蛋白单一性较好,分子量为47 ku,与CIV全病毒血清抗体可发生特异性结合反应,且头部去除区HA蛋白血清抗体可抑制H1N1和H3N2亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应,中和效价分别为1∶160和1∶320。研究结果为制备针对不同亚型流感病毒(如H1N1和H3N2)的广谱疫苗提供了可能。 相似文献
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目的选取PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的片段进行重组表达。方法对PPRV和RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa蛋白片段基因进行大肠杆菌偏爱密码子优化后人工合成,利用分子生物学技术,将目的基因分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),诱导表达并纯化PPRV与RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa片段。结果得到了分子量分别约17.8kD、20.6kD的各两段融合蛋白。结论本研究成功表达了PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的51-175aa和376-525aa蛋白片段,为制备能区别PPR和RP病毒的特异性单抗提供了抗原。 相似文献
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为优化H10亚型禽流感病毒快速检测方法,按照鸡偏嗜性密码子将A/Jiangxi/IPB13/2013(H10N8)的血凝素(HA)基因序列优化后人工合成,克隆至真核表达载体pCAGGs。将重组质粒双酶切后测序证明该质粒构建成功。用200μg的表达载体免疫6周龄SPF鸡,分别在第一次免疫后的第30天和第60天用相同剂量实施第二次和第三次免疫,末次免疫后的第10天心脏采血,分离血清,制备单因子血清。间接免疫荧光试验和western blot试验证明HA蛋白成功表达,单因子血清制备成功。血凝抑制试验结果表明抗体效价≥128,单因子血清特异性强,与其他亚型禽流感病毒无交叉反应。该研究为H10亚型流感病毒快速鉴定和研究奠定了基础。 相似文献
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为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。 相似文献
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为制备蛋鸡TRPV6蛋白多克隆抗体,根据其基因序列,设计1对特异性引物,以卵巢组织中提取的总RNA为模板,扩增蛋鸡TRPV6基因1 801～2 176nt的375bp序列,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-TRPV6;将重组质粒转化BL21（DE3）,经IPTG诱导表达TRPV6融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡TRPV6多克隆抗体,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法和Western blot检测抗体的效价和抗体特异性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-TRPV6,SDS-PAGE蛋白电泳检测发现目的蛋白大小约35 000;Western blot分析显示,表达的TRPV6融合蛋白具有良好的免疫原性,其抗体可与大肠杆菌表达的产物特异性结合;ELISA显示其抗体效价达1∶100 000。获得纯化的融合蛋白和多克隆抗体对研究TRPV6钙离子通道在蛋鸡髓质骨形成的作用机理具有重要作用。 相似文献
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本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌（Brucella abortus）2308的BspD基因序列（GenBank登录号：NC_007618.1）获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后将目的基因嵌入pMD19-T载体,使用限制性内切酶切下目的基因重组入pET-28a（+）载体,构建pET28a-BspD重组载体,经过双酶切、测序验证后,IPTG诱导表达菌株,SDS-PAGE法鉴定BspD的表达,His标签蛋白纯化柱纯化BspD蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。用纯化BspD蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体的效价及反应原性。结果表明,成功表达出37 ku BspD蛋白,BCA方法测得纯化BspD浓度为2 000 μg/mL;Western blotting结果显示制备的抗体具有良好的特异性,间接ELISA检测出BspD多克隆抗体的效价为1：12 800,成功制备出BspD多克隆抗体,但其反应原性较低。生物学信息分析得出BspD蛋白具有亲水性,存在跨膜区,无信号肽,有17个磷酸化位点和11个抗原决定簇,BspD蛋白二级结构以α-螺旋为主,达到86.80%,还存在少量延伸链、无规则卷曲、β-折叠等;在线软件Phyre 2构建BspD三级结构证实其多为α-螺旋。以上结果可为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白BspD的功能及分子机制提供参考。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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MAO Qian-qian ZHOU Ling TANG Qing-hai BU Bin TANG Cun-duo JIAO Zhu-jin YAO Lun-guang KAN Yun-chao YANG Jian-wei CUI Shang-jin 《中国畜牧兽医》2016,43(7):1659-1666
This study was aimed to prepare canine parvovirus (CPV) VP2 protein polyclonal antibody.The recombinant expression vector pET28a-CPV-VP2 was constructed and transfromed into E.coli BL21 (DE3),the expression of recombinant proteins was induced by IPTG from which the fusion protein was identified by SDS-PAGE.The target protein was purified and emulsify with adjuvant,the prepared immunogen was inoculated into rabbit by subcutaneous injections to prepare of VP2 protein specific polyclonal antibody.The immuno-activity,titers,neutralization titers of the prepared polyclonal antibody were determined by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA).The results showed that the expressed recombinant protein VP2 (rVP2) existed in the form of inclusion body with a molecular weight of 72 ku.The prepared polyclonal antibody titer was 1 600 dilution,the virus titer was 107 TCID50/mL,the neutralizing titer was 1∶2 884.The antibodies showed specific reaction with CPV.In conclusion,rVP2 specific polyclonal antibody showed wonderful immunocompetence,specificity and neutralizing activity,providing foundation for the development of genetic vaccine and clinical therapeutic method. 相似文献