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本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体.采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达.将pCAGGS-HA以100 μg·只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11.其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1:8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应.该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础. 相似文献
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为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的. 相似文献
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为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具. 相似文献
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为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。 相似文献
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流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤.2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化.本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4 (TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能.本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据. 相似文献
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根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基... 相似文献
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为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。 相似文献
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2012年从广东省某猪场的疑似流感猪群采集鼻拭子样品,接种鸡胚并收集尿囊液,通过血凝、血凝抑制和RT-PCR,鉴定出1株H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/GD/2/12。RT-PCR扩增得到全基因8个片段,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树,发现本毒株可能是H1N1亚型重组株,其8个片段与我国猪源和北美地区1985—1992年间的猪源、禽源(A/turkey/IA/1992)和人源(A/Maryland/12/1991)流感毒株在同一个大分支上,其中与我国猪源参考株同源性在95.8%以上,与北美地区的H1N1参考株同源性在94%以上。HA受体位点分析表明,本毒株既具备结合Saα2,6Gal型人类流感病毒SA受体的特点,也有结合Saα2,3Gal型禽类流感病毒SA受体的可能。提示本毒株可能是由北美地区猪源、禽源和人源的H1N1亚型流感病毒重排形成的。HA蛋白裂解位点分析、NS和PB2蛋白位点分析表明,本毒株具备低致病性毒株的特点。小鼠致病性试验进一步证实本毒株能够引起小鼠运动减少、食欲欠佳、体重减轻等表现,但不会引起咳嗽和死亡等严重反应。 相似文献
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H5N1亚型猪流感病毒A／Swine／Fujian／1／01感染性克隆构建及其对小鼠致病性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
2001年从福建某猪场分离到1株H5N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Fujian/1/01(SW/FJ/1/01).SW/FJ/1/01对小鼠具有强致病性,致死率为100%,为进一步研究SW/FJ/1/01对BALB/c小鼠致病性的分子基础,本研究构建了SW/FJ/1/01的8个节段重组质粒构成的反向基因操作系统,成功拯救了病毒(R-SW/FJ/1/01).R-SW/FJ/1/01和野生型SW/FJ/1/01对BALB/c小鼠致病性没有差别.SW/FJ/1/01反向基因操作系统的建立为进一步阐明H5N1亚型SIV对哺乳动物模型BALB/c小鼠的致病机制等方面的研究奠定了基础. 相似文献
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Schwarz S Werckenthin C Alesík E Wieler LH Wallmann J 《Berliner und Münchener tier?rztliche Wochenschrift》2007,120(9-10):363-371
A total of 368 bacterial pathogens, including 72 coagulase-positive and coagulase-variable staphylococci, 97 beta-haemolytic streptococci, 51 Escherichia coli, 75 Pasteurella multocida, 25 Mannheimia haemolytica, 25 Pseudomonas aeruginosa, and 23 Arcanobacterium pyogenes, were investigated for their susceptibility to the three combinations of antimicrobial agents lincomycin/spectinomycin (1/2), penicillin G/neomycin (1/1), and penicillin G/dihydrostreptomycin (1/1) in comparison to their susceptibility to the corresponding single substances. When comparing the minimum inhibitory concentrations (MICs) determined for any of the three combinations with those for the single substances, the lowest MIC of one of the two substances usually determined the MIC of the combination.This observation was made for all three combinations and all bacterial pathogens tested.Thus, it is assumed that the combination of lincomycin with spectinomycin as well as that of penicillin with either neomycin or dihydrostreptomycin resulted in an extended spectrum of target bacterial pathogens rather than in an increase in antimicrobial efficacy. 相似文献
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2009年3以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了甲型H1N1流感[Swine-origin Influenza A (A/H1N1)]疫情,WHO已于2009年6月20日将此次流感流行的预警级别提升至6级.现已基本明确,引起此次流感疫情的A/H1N1流感病毒是猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)的一种新型变异株.此次流感疫情的发生,再次使猪流感成为社会各界关注的焦点之一.本文就甲型H1N1流感的临床表现、病毒特征、相互关系及其对动物卫生监督工作的影响等作一综述. 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):389-394
采用套式PCR检测方法,结合鸡胚分离鉴定,从20份患呼吸道疾病猪的鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒。经亚型鉴定及全基因组序列分析,证实该分离株为H1N1流感病毒,命名为A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)。遗传进化分析表明该分离株与类禽猪流感病毒(Avian-Like H1N1)相似性最高。蛋白序列分析发现,该分离株具有低致病性流感病毒特征,即其HA蛋白的裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI。此外,该基因中有7个潜在的糖基化位点,受体结合位点为108(Y)、148~152(GVTAA)、167(W)、197(H)、204~212(DQQ SLYQNA)和238~243(RDQEGR);其中225~228EQAG显示该分离株具有结合SAα2,6Gal受体的能力,证明该分离株具有感染哺乳动物的能力。同时PB2蛋白的627E、701N及NS蛋白的92D位点均证明了该分离株的低致病性和感染哺乳动物的能力。 相似文献
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H1N2亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／06分离鉴定和对猪致病性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒.用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型.挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较.核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(HIN2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%.以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道.但不表现临床症状.本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义. 相似文献
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Strain A/swine/Wisconsin/1/68 (WI/68) swine influenza virus (SIV) was propagated in embryonating chicken eggs at 33, 35, or 37 C. The SIV harvested from eggs incubated at 33 C invariably had higher hemagglutination (HA) and egg infectivity titers than did SIV propagated in eggs at the 2 higher temperatures. When SIV inoculum propagated at 33 C was inoculated into separate groups of eggs and incubated at 33, 35, and 37 C, the SIV harvested from inoculum incubated at the 2 higher temperatures had significantly lower infectivity and HA titers than did that propagated at 33 C. By electron microscopy (EM), viral particles of Wi/68 were of various sizes and shapes regardless of the temperature used to propagate the virus. However, in contrast to what was seen in SIV harvested from innoculum incubated at 33 C incubation, pleomorphic shapes and particles with surface abnormalities were much more frequent in SIV harvested from inoculums kept at the 2 higher temperatures. Approximately one-third of the particles from 35 and 37 C incubation either were spikeless or were relatively deficient in surface spikes. 相似文献
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为了解H5N1亚型禽流感病毒经自然途径感染SPF鸡后，病毒的致病能力与NS基因的关系，本文主要从病理学角度比较了两株利用反向基因操作技术拯救的病毒RGSGD／1／96和RGSGD／1／2NS的致病能力。虽然只有NS基因不同，但是这两株病毒经鼻腔感染4周龄SPF鸡后表现出完全不同的致病能力，RGSGD／1／96对鸡的致死率为100％，感染鸡只的各组织脏器均可发现严重的病理损伤，该病毒在鸡体内复制能力很强，感染后3d、6d，各组织脏器均可发现大量的病毒抗原；GSGD／1／2NS对鸡的致死率为0，病毒在感染鸡体内只引起肺间质少量淋巴细胞浸润，免疫组织化学检查未发现病毒抗原信号。由于两株病毒只有NS基因不同，说明NS基因决定了H5N1亚型禽流感病毒A／goose／Guangdong／1／96对SPF鸡的致病能力。 相似文献
