共查询到20条相似文献，搜索用时 66 毫秒
1.
依据GenBank猪肠激酶催化亚基(EKL)基因的编码序列设计引物,通过RT-PCR方法从猪小肠黏膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和Not Ⅰ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建EKL基因分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL.重组质粒载体经Sal Ⅰ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中.然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选获得高拷贝猪EKL基因的重组酵母.经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中.重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到相对分子质量为35 000的重组蛋白.经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明制备的重组猪EKL具有生物活性. 相似文献
2.
袁芳艳;刘泽文;周丹娜;杨克礼;段正赢;郭锐;田永祥 《湖北畜牧兽医》2013,(9):5-8
利用RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因,亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子,经SDS-PAGE和Western-blot检测,H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达,产物约60.4KD,并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。 相似文献
3.
重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性. 相似文献
4.
将番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因插入到酵母表达载体pPIC9K内,转化大肠杆菌TG1,挑取阳性克隆,获得酵母表达重组质粒pPIC9K-σC。用DraⅠ酶切线性化重组表达质粒pPIC9K-σC和对照质粒pPIC9K,电转化至甲醇酵母GS115感受态细胞内,经G418抗性筛选和PCR鉴定,获得了2株pPIC9K-σC酵母阳性整合子和2株pPIC9K空载体对照酵母阳性整合子。分别挑取1株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测发现pPIC9K-σC酵母整合子在不同时段的诱导表达上清液中均有可见的目的蛋白条带,分子质量与预计大小相符,而对照pPIC9K酵母整合子的诱导表达上清液中没有相应的蛋白条带。说明番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因真核甲醇酵母表达体系构建成功,目的σC蛋白在酵母中能够有效地分泌表达。 相似文献
5.
中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测 总被引：1，自引：1，他引：0
将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。 相似文献
6.
SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2010,(7)
为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。 相似文献
8.
将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。 相似文献
9.
为探索层粘连蛋白G结构域在甲醇型酵母（Pichia Yeast）中的表达，用PCR的方法获得了鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3（LG4-5）和E8（LG1-3）基因片段，并将其克隆到P．pastoris分泌型表达载体pPIC9中，构建了pPIC9-E3和pPIC9-E8等2个毕赤酵母重组质粒。将测序正确的质粒用电转化的方法转化酵母表达受体菌GS115。通过表型和PCR的方法筛选出P.pastoris重组子。用甲醇诱导表达后．进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果表明，鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3和E8片段在毕赤酵母中获得了成功的表达。 相似文献
10.
口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。 相似文献
11.
兽用合成抗菌药的安全使用 总被引：1，自引：1，他引：0
抗菌药物在保障畜禽健康、促进畜禽生长、提高经济效益方面起了积极的作用。然而长期使用,具有危害性。首先,导致细菌产生耐药性;其次,敏感菌得到了控制,不敏感菌或耐药菌乘机大量繁殖,产生新的致病菌, 相似文献
12.
选用断奶仔猪肠道中的大肠杆菌K88和猪霍乱沙门菌作为指示菌。杀菌性能的测定采用最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并绘制杀菌曲线。原子吸收光谱仪测定Cu2＋在肉汤和生理盐水中的释放量;透射电镜观察细菌细胞壁的变化;全自动生化分析仪测定细菌胞内酶的活性;通过K＋电极测定K＋释放量;采用SP-2型溶氧仪测定菌体悬浮液中的溶氧量。结果显示,载铜蒙脱石对E.coli K88的MIC为64mg/L,MBC为256mg/mL;对S.choleraesuis的MIC为128mg/L,MBC为512mg/L。而蒙脱石未显抗菌活性。透射电镜下观察细菌与载铜蒙脱石作用后形态发生了变化,细菌细胞膜受损,内容物外漏;细菌胞内酶活性结果显示,胞内酶的大量外漏,与对照组相比,均差异极显著（P〈0.01）;大量自由的K＋从细菌细胞内释放出来;呼吸代谢结果显示,载铜蒙脱石抑制了细菌呼吸代谢的三羧酸循环途径。结果表明,载铜蒙脱石具有强大的杀菌作用。 相似文献
13.
14.
为探讨嗜驼璃眼蜱血淋巴中抗菌肽的电泳分析方法及其抗菌作用，从半饱血的嗜驼璃眼蜱雌蜱体内抽取血淋巴，用50mL／L的乙酸抽提，经AU—PAGE分析嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分，用电泳凝胶琼脂糖弥散法对各多肽进行抗菌活性的筛选。结果表明，嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抗菌作用。AU—PAGE发现一电泳迁徙率明显高于溶菌酶的阳离子抗菌多肽。提示在嗜驼璃眼蜱的血淋巴中，存在与溶菌酶不同的抗菌多肽，可能是嗜驼璃眼蜱抵御感染的重要分子。AU—PAGE是一种较简单、快速、经济的分离纯化抗菌肽的方法。 相似文献
15.
细菌性疾病严重危害动物机体健康，影响畜牧养殖业经济利润。抗菌药物已诱导多种细菌产生耐药性，这在一定程度上降低了其治疗效果。然而，通过提高抗菌药物使用剂量以加强疗效不仅容易引起毒副作用，还易导致药物残留。因此，寻找新方案来提升传统抗菌药物的抗菌活性成为药物研究者工作重点。以传统抗菌药物作为客体分子，利用包合技术将其同价格低廉的环糊精等主体分子制成包合物，可改善药物理化性质及抗菌活性，显示出良好发展前景。包合物不仅能改善药物溶解性、稳定性，还兼具备缓释效果，可有效提高抗菌药物生物利用度。同时，其还能与细菌膜结合，协助抗菌药物穿越膜结构，最终提高药物抗菌效果并降低抗菌药物使用剂量。本文将从包合技术的发展历史、增强抗菌药物活性应用现状以及提高抗菌药物药效学机制三个方面进行总结，以期为兽药研究者提供有效的借鉴。 相似文献
16.
细菌耐药性问题已成为全世界的共同挑战，其导致抗菌药物的作用下降，细菌性疾病发病率及死亡率不断攀升。疾病治疗难度加大、治疗费用增加以及动物生产力的持续降低，给畜牧养殖业造成严重经济损失。因此，寻找新方案以对抗耐药细菌尤为重要。纳米技术于近代兴起，被广泛运用于生物医学等多个领域，在对抗耐药细菌方面具有显著优势。纳米技术可通过破坏细菌细胞膜、抑制外排泵、产生活性氧（ROS）、抑制和降解生物被膜等多种机制降低细菌抗性。本文将从纳米技术的应用历程、对抗耐药菌的策略以及对抗耐药菌机制等三个方面进行简要概述，以期为兽药研究者提供一定借鉴。 相似文献
17.
[目的]研究抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性。[方法]利用抗性平板划线法从腹泻病牛血便中筛选分离出1株耐药菌,通过16S rDNA序列进行鉴定,采用琼脂孔穴扩散法通过梯度盐酸壮观霉素（spectinomycin,Spe+）、氨苄青霉素（ampicillin,Amp+）、硫酸卡那霉素（kanamycin,Kan+）和氯霉素（chloramphenicol,Cm+）试验确定该菌药敏特性,并利用1种抗菌肽制剂对该菌株进行药敏试验。[结果]经BLAST比对分析该菌16S rDNA序列,鉴定该耐药菌为科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）,此菌对Amp+敏感,但对试验中其他抗生素均有耐药性,各梯度抗菌肽对该耐药菌均具有明显的抑菌活性。[结论]抗菌肽能有效抑制耐药科氏葡萄球菌的生长,有望在畜牧生产中代替抗生素使用。 相似文献
18.
猪小肠抗菌肽的抗菌作用研究 总被引：26，自引：0，他引：26
采用琼脂糖弥散试验和活菌计数试验检测猪小肠抗菌肽对儿株细菌(鸡大肠杆菌(O1)C83845株、鸡白痢沙门氏菌C79-13株、大肠杆菌(O2)、大肠杆菌(O78)、猪致病性大肠杆菌自然分离株、鸡致病性大肠杆菌自然分离株、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923株、猪致病性沙门氏菌自然分离株、绿脓杆菌ATCC27853株、鱼致病性嗜水气单胞菌)的作用。结果表明，猪小肠抗菌肽对以上各株细菌均有不同程度的抑制作用，杀菌率由59．5％～98．5％不等。扫描电镜下观察猪小肠抗菌肽分别与鸡大肠杆菌(O1)C83845株、鸡白痢沙门氏菌C79-13株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株在37．0℃条件下共培养15min后细菌形态学的改变，结果发现，有的细菌表面出现囊泡样或不规则突起样结构；有的细菌严重变形、扭曲，一端呈火柴头状；有的细菌表面变得粗糙、皱缩、胞膜破裂、内容物外流而死亡。 相似文献
19.
黄芩等六种中草药的体外抑菌试验 总被引：1，自引：0，他引：1
应用平板打孔法和试管两倍稀释法检测了本地常见清热型中草药黄芩、青葙子、五色梅、一点红、鸡蛋花、少花龙葵等对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制作用。结果表明:沙门氏菌对黄芩、一点红和鸡蛋花呈高度敏感,最小抑菌浓度在1/40～1/10之间;对少花龙葵呈中度敏感,最小抑菌浓度为大于1/10;而对青葙子和五色梅不敏感。大肠杆菌K88对黄芩、一点红、鸡蛋花和少花龙葵都呈高度敏感,黄芩和鸡蛋花的最小抑菌浓度在1/20～1/10;一点红和少花龙葵大于1/10;对青葙子和五色梅不敏感。大肠杆菌26和大肠杆菌40除对黄芩呈高度敏感外,对其他5种中草药均不敏感。 相似文献