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1.
兔出血症病毒胶体金免疫层析试纸条诊断方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立一种快速、简便的兔出血症病毒(RHDV)的检测方法,用胶体金标记纯化的RHDV多克隆抗体,以杆状病毒表达系统表达的重组RHDV VP60蛋白为免疫原制备RHDV的单克隆抗体(McAh,简称单抗)A3C,将RHDV McAb和羊抗兔IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化研制成RHDV免疫胶体金试纸条.该试纸条可以检出红细胞凝集试验(HA)效价为1:10的RHDV悬液,即HA检测为阴性的样品,该试纸条检测为阳性,其敏感性高于HA;特异性试验结果显示,该试纸条不与家兔其他常见病菌发生交叉反应.应用该试纸条对127份疑似兔出血症家兔肝脏样品进行初步检测,同时用HA做平行试验,阳性符合率为100％.因此,该试纸条是一种快速、灵敏、特异的兔出血症病毒检测方法,为兔出血症的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景. 相似文献
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为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。 相似文献
3.
兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果 总被引：2，自引：1，他引：1
用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化 总被引：2，自引：0，他引：2
以重组兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白为抗原，建立了RHDV抗体间接ELISA检测方法。优化的试验反应务件为：重组VP60的包被质量浓度为1．0mg／L，用10％牛血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的ELISA与现行血凝抑制(HI)试验比较发现，不同免疫状态的兔血清的RHDV ELISA抗体与HI抗体均呈正相关。对11个RHD免疫兔场1130份血清样品的抗体检测表明，各免疫兔群血清RHDV抗体水平不完全一致，D值在1．09～1．76之间，显著高于非免疫兔(0．05)及SPF兔(0．02)，低于高免兔(2．34)。在此基础上，研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒，测定了其主要指标，制定了各成分的质量控制标准，为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。 相似文献
5.
采用RT-PCR技术从滨州分离株中扩增出传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP4基因,将VP4基因插入到pGEX-4T-1载体上构建pGEX-4T-1-VP4,诱导表达并用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化得到纯化的重组VP4蛋白。以兔抗鸡IgG为胶体金标记物,以重组IBDV VP4蛋白和羊抗兔IgG为硝酸纤维素膜检测线和质控线的包被物,制备一种能检测IBDV VP4蛋白抗体的胶体金试纸条。结果表明,该试纸条检测IBDV强毒(IBDV BC6/85)免疫的血清检测线显红色,为阳性反应;检测IBDV弱毒(IBDV NB)免疫的血清、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)标准阳性血清、禽流感H5和H9标准阳性血清、传染性支气管炎标准阳性血清及0.85%生理盐水检测线不显红色,为阴性反应。该试纸条与建立的ELISA方法相比,敏感度低2个滴度;检测320份临床血清,试纸条与ELISA的符合率达99.38%。提示,该试纸条使用方便、操作简单,10 min内可以用肉眼判断结果,可为区分IBDV的强弱毒提供参考数据,具有较大的应用价值。 相似文献
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为了解不同猪口蹄疫O 型抗体检测试纸条的性能,通过检测已知相关及非相关阳性血清样品、阴性血清样品和免疫
猪血清样品,对4种猪口蹄疫O型抗体检测试纸条的敏感性、特异性进行研究评估,并对比猪口蹄疫O型VP1结构蛋白抗体ELISA诊断试剂盒的检测结果。结果表明,仅有A试纸条的敏感性和特异性较好,且与试剂盒抗体检测结果的符合率较高（90%）;而其他试纸条的敏感性和特异性较差,与试剂盒抗体检测结果的符合率较低（40%～65%）。通过对比检测,仅有A试纸条可用于大量临床样品的快速检测和现场检测,更适合基层兽医和养殖户使用,而其他试纸条的检测性能还有待进一步优化提升。 相似文献
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本试验旨在迅速、准确检测口蹄疫阴性血清和阳性血清,确立O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准。通过3批次O型口蹄疫抗体金标检测试纸条,对180份猪、牛、羊口蹄疫阴性血清,197份猪、牛O型口蹄疫弱阳性血清,317份猪、牛、羊O型口蹄疫阳性血清,223份牛Asia 1、A型口蹄疫阳性血清,600份田间血清样品进行检测,同时用O型口蹄疫液相阻断ELISA和O型口蹄疫正向间接血凝2种方法检测相同的血清样品。对3种方法检测的结果进行分析,并且将试纸条的检测线和质控线的显色情况与O型口蹄疫液相阻断ELISA的抗体滴度相比较。确立了试纸条的诊断标准:试纸条抗体滴度1∶2-为口蹄疫抗体阴性;试纸条抗体滴度1∶8+为O型口蹄疫阳性血清。根据试纸条的显色结果与液相阻断ELISA的结果的关系,绘制了比色卡。试纸条的判定标准检测血清结果与液相阻断ELISA和正向间接血凝结果分别进行统计学分析,试纸条与液相阻断ELISA和正向间接血凝相关性分别为y=1.142x+0.7421,y=1.1845x+0.8623;相关系数(r)分别为0.9221和0.9033。结果显示,O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准的确立和比色卡的绘制,实现半定量分析,更加迅速、准确,适于实验室、基层兽医站和养殖场使用。 相似文献
8.
建立一种检测兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法。对RHDV陕西分离株VP60基因进行原核表达,Western blot分析表达产物的免疫反应性;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP60蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为42.34 ku的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被浓度2.9μg/mL,37℃2 h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2 h,待检血清37℃孵育1 h,酶标抗体1∶10 000稀释,37℃作用1 h,37℃显色5 min,临界值为0.340;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与血凝抑制试验的符合率为74.1%,与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%。该方法可用于临床样品的大批量检测。 相似文献
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研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线（T）和质控线（C）。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。 相似文献
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利用SUMO-BCSP31重组大肠杆菌表达并纯化了布鲁菌BCSP31重组蛋白,并利用该蛋白研制了布鲁菌免疫胶体金检测试纸条。以BCSP31蛋白作为检测抗原,通过间接法研制胶体金试纸条检测鹿血清抗体。该试纸条与大肠杆菌、沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌和绿脓杆菌无交叉反应;检测阳性血清最大稀释倍数为1∶640,证明试纸条具有良好的特异性和敏感性。临床上对420只鹿进行检测,比对试纸条与虎红平板凝集试验(RBT)检测结果:阳性符合率为100%,阴性符合率为96%,Kappa值为0.73,两种方法符合率较高;比对试纸条与cELISA检测结果:阳性符合率为81%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.88,两种方法符合率高。该试纸条简便快捷,具有较高准确性,可用于鹿布鲁菌病的现场初筛检测。 相似文献
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试验旨在利用胶体金免疫层析技术建立快速检测犬血清中犬细小病毒（canine parvo virus, CPV）血凝抑制（haemagglutination inhibition, HI）抗体效价的方法,用于CPV疫苗免疫效果评价。采用双抗体夹心法,以抗CPV血凝相关抗原的单克隆抗体制备CPV抗原检测试纸条;将犬血清进行不同比例系列稀释后,分别与定量CPV抗原充分反应,滴入CPV胶体金试纸条,根据试纸条检测线（test line,T线）消失时的血清最高稀释倍数判断血清中CPV抗体的HI效价;用此方法检测86份犬血清样品,并与传统血凝抑制试验方法进行分析比较。结果显示,成功制备CPV抗原检测试纸条,确定了试纸条检测犬血清CPV-HI效价的反应条件和结果判定标准。结果表明,在检测不同稀释倍数犬血清反应后的CPV抗原时,能使试纸条T线消失时的血清最高稀释倍数与HI效价具有正相关性,犬血清最高稀释倍数乘以4即为HI效价;两种方法的符合率达90.7%。本试验初步建立了胶体金试纸条检测CPV血凝抑制效价的方法,为检测CPV-HI效价提供了一种操作简单、快速的试验方法,可用于CPV疫苗免疫效果评价。 相似文献
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为评价狂犬病病毒抗体纳米荧光试纸条的性能,使用该试纸条,对A、B、C 3组不同免疫阶段犬血清进行抗体检测,并对122份临床犬血清,同时使用试纸条、SYNBIOTICS试剂盒、北京世纪元亨ELISA试剂盒进行抗体检测。结果显示:未免疫狂犬病疫苗的A组,抗体水平极低;免疫1个月后的B组,抗体水平迅速升高;免疫2个月后的C组,抗体水平出现回落。试纸条与SYNBIOTICS试剂盒的阳性符合率为92%,阴性符合率为91.67%,总符合率为90.17%;与北京世纪元亨试剂盒的阳性符合率为96.16%,阴性符合率为97.15%,总符合率为96.73%。结果表明,试纸条可以真实反映不同免疫阶段的狂犬病病毒抗体变化,与国内外商品试剂盒符合率高,可应用于狂犬病疫苗免疫后的临床效果评估,指导临床建立合理的免疫策略。 相似文献
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为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2019,(5)
本研究分别以布鲁菌LPS和牛分枝杆菌MPB70蛋白作为检测抗原,建立了动物布鲁菌病和结核病双抗原夹心法胶体金抗体检测技术,并研制了同时检测动物布鲁菌病和结核病的快速抗体检测试纸条,用于动物布鲁菌病和结核病临床快速血清抗体检测。检测试纸条与其他病原无交叉反应,与牛、鹿口蹄疫血清、巴氏杆菌病血清、耶尔森氏菌病血清无交叉反应;敏感性高,临床采集的布鲁菌病和结核病阳性血清最大稀释倍数可以达到1:512;特异性好,准确率高。研制的检测试纸条与现有的检测方法具有较高符合率:与RBT检测布病结果阳性符合率为100%,阴性符合率为96%,总符合率为96%;与牛结核γ-干扰素ELISA检测结核病结果阳性符合率94%,阴性符合率为97%,总符合率为96%。试纸条检测卡在吉林省多个地区进行临床试验,具有快速、敏感、特异、操作简单、可以用于现场快速检测等优点,能够同时用于动物布鲁菌病和结核病的临床抗体检测。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(12)
试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。 相似文献
17.
《中国兽医杂志》2019,(1)
采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2021,(5)
为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57℃～2.74℃,能够达到鉴别检测的目的。特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强。敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2 VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×10~1拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5%,重复性好。采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出。利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3%。本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障。 相似文献
19.
《中国兽医学报》2019,(5):931-935
基于上转发光免疫层析(UPT-LF)技术,旨在建立UPT-LF快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体的方法。采用间接法制备UPT-LF试纸条,通过共价偶联使二抗山羊抗猪IgG和上转发光纳米颗粒(UCP)结合,并加入样品垫和被检血清结合,以旋毛虫肌幼虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因(WM5)表达的蛋白WM5为猪抗旋毛虫IgG特异性结合抗原,WM5(2 g/L)与兔抗山羊IgG(0.5 g/L)喷点于分析膜上作为UPT-LF试纸条检测带(T)与质控带(C),该试纸条命名为Tsp-UPT-LF。Tsp-UPT-LF通过对95份阴性血清检测,确定Tsp-UPT-LF的Cutoff值为0.099。Tsp-UPT-LF和ELISA分别对273份旋毛虫感染猪血清样本进行检测,总符合率为92.31%,一致性系数Kappa(K)值为0.837,表明两种方法具有高度一致性。Tsp-UPT-LF检测旋毛虫、猪囊虫、华支睾吸虫感染的猪血清Tsp-UPT-LF呈现对旋毛虫良好的特异性。Tsp-UPT-LF检测感染50 000条旋毛虫肌幼虫28 d猪血清为阳性,T/C值0.109,122 d阳性最强,T/C值为0.207,至425 d时阳性值有所下降,抗旋毛虫IgG阳性率为71.4%。本研究建立了基于UPT-LF技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体的方法,为猪旋毛虫即时感染检测、确保食品安全提供了一种可参考的检测方法。 相似文献
20.
为了对南部县某兔场疑似兔出血症病毒(RHDV)NB毒株进行鉴定,试验采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、家兔接种试验、家兔免疫攻毒试验、VP60基因的同源性比对。结果显示:NB毒株能凝集人"O"型红细胞,HA效价为12 log2,其血凝性能被RHDV疫苗毒株AV33株的抗血清抑制;NB毒株注射健康非免家兔,家兔在48h内死亡,具有典型的兔病毒性出血症(RHD)的临床症状和病理变化;RHDV(AV33)组织灭活疫苗免疫家兔后,家兔能抵抗NB毒株的攻击;NB毒株与AV33毒株的VP60基因同源性为96.12%,氨基酸序列同源性为97.59%。 相似文献