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1.
《中国动物传染病学报》2019,(6)
为建立猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异毒株和传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法,本研究根据GenBank中PEDV变异毒株(JN381492.1)和传统毒株(JN599150.1)S基因序列,设计两对特异性引物,进行反应条件优化。结果显示:建立的RT-PCR鉴别诊断方法能够特异性区分PEDV变异毒株和传统毒株,能扩增出变异毒株442 bp的目的片段,而传统毒株是270 bp的目的片段,并且与猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪呼肠孤病毒、猪瘟病毒、猪脑心肌炎病毒、轮状病毒均无交叉反应;敏感性结果表明该方法能检测出变异毒株和传统毒株的底限均为4×104 copies;利用该方法对42份临床腹泻样品进行检测,PEDV阳性率为69%(29/42),变异毒株占总PEDV毒株的93.1%(27/29),传统毒株占总PEDV毒株的6.9%(2/29)。该RT-PCR方法为PEDV的病原鉴别诊断和流行病学调查提供了技术手段。 相似文献
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为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明：优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率... 相似文献
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猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。 相似文献
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猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2017,(2):83-88
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。 相似文献
6.
为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
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为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
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为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。 相似文献
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为了建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)经典毒株和变异毒株的双重实时荧光定量PCR方法，试验根据GenBank上收录的30株PRV设计gE基因和gC基因的特异性引物和探针，构建含有gE基因和gC基因的标准质粒，优化扩增体系建立双重实时荧光定量PCR方法，并检验该方法的特异性、敏感性和重复性，同时绘制标准曲线，最后采用该方法对临床样品进行检测。结果表明：试验建立的双重实时荧光定量PCR方法的最佳退火温度是60℃,最佳引物体积为0.8μL,最佳探针体积为0.4μL。该方法对猪场常见疫病病原猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应，特异性强；对两种标准质粒pUC57-gE和pUC57-gC的最低检测限均为1×101copies/μL,gE基因和gC基因对应的标准曲线分别为y=-3.446x+41.920(R2=0.998)和y=-3.255x+39.185(R2... 相似文献
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从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。 相似文献
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根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
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猪脑心肌炎的诊断与科学防治 总被引：1，自引：0，他引：1
猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephaiomyocarditis virus,EMCV)引起的猪、某些啮齿动物和灵长类动物的一种以脑炎和心肌炎为特征的人畜共患传染病.主要从病原、流行病学、临床症状、防治措施等方面对猪脑心肌炎进行阐述,以期为科学防治该病提供参考. 相似文献
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非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(ASFV)检测,本研究建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法,该方法采用纳米金颗粒作为热导介子,提高了PCR反应效率,采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、典型猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪捷申病毒、猪脑心肌炎病毒等,结果只有ASFV能够扩增出552 bp的目的片段。敏感性试验表明纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍以上,最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性,在以上3个地区均未发现ASFV感染情况。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(5)
为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。 相似文献
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根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。 相似文献
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为了建立一种能在临床上快速鉴别猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)野毒和弱毒疫苗毒的检测方法,试验在对多株CSFV基因组序列比对分析后,选择特异保守区域设计2对引物构建CSFV强弱毒株双重RT-PCR方法,优化其退火温度,并检测该方法的特异性、敏感性及临床应用效果。结果表明:试验建立的双重RT-PCR方法能从CSFV弱毒疫苗毒和临床野毒株基因组中扩增出大小分别为447 bp和343 bp的特异性基因片段;最佳退火温度为55℃;应用该方法分别对繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗毒、猪口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗毒、猪乙型脑炎病毒(JEV)弱毒疫苗毒总RNA和猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗毒、猪细小病毒(PPV)灭活疫苗毒、猪圆环病毒(PCV)灭活疫苗毒的总DNA进行检测,均未见特异性条带,特异性好;对CSFV疫苗弱毒的最低RNA检出量为6.28 ng,敏感性高;对临床混合感染病料进行检测,能同时或单独检测到CSFV强毒和CSFV弱毒疫苗毒核酸。说明试验建立的双重RT-PCR方法特异性好,敏感性高,可用于CSFV强弱毒株的检测。 相似文献