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猪肺炎支原体P102基因C末端序列的克隆及原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
应用DNA重组技术，将猪肺炎支原体P102的C末端基因克隆到pET-28a表达载体上，并构建了重组表达载体；将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，用终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导5h，然后用Bug BusterTM Ni—NTAHis·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行纯化。ELASE检测结果表明：该蛋白具有良好的生物学活性。利用纯化蛋白制备高免血清为检测P102蛋白在真核系统中的表达奠定基础。 相似文献
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用DNA重组技术，将已克隆的猪IL-6基因阅读框片段插入非融合原核表达质粒pBV220中的适当位置，获得重组质粒pBVpIL-6，转化大肠杆菌DH5α后，42℃诱导阳性表达菌。经SDS-PAGE检测发现目的蛋白获得了高效表达，表达量约占总蛋白的20％。表达的蛋白以包涵体形式存在，包涵体经过变性溶解和复性后用酶联免疫吸附试验（ELISA）做定性定量检测。ELISA结果证实了所表达的蛋白为猪IL-6，复性后具有一定活性．并测出了复性后活性蛋白的浓度。 相似文献
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荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达 总被引：4，自引：0，他引：4
应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。 相似文献
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动物乳腺生物反应器是应用重组DNA技术和转基因技术,获得的在乳腺中特异表达外源基因、高效生产活性功能蛋白的转基因动物个体。动物乳腺生物反应器主要用于生产重大疾病防治的蛋白等创新型药物品种,是国家战略性新兴产业的重点发展内容。转基因动物作为乳腺反应器生产药用蛋白,将拓宽畜牧生产领域,使畜牧业成为现代生物医药的上游产业,国家战略性新兴产业的基础产业,是未来畜牧科技创新的亮点和特点。 相似文献
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为验证牛分枝杆菌外膜蛋白A是否具有免疫活性,以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板扩增牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA,采用DNA重组技术将此基因片段连于表达载体pGEX6p-1,构建重组质粒pGEX6p-1-ompA,并将其转化到大肠杆菌中BL21(DE3)中,IPTG诱导(终浓度为0.1mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析.用glutathione sepharose 4B纯化蛋白和Western blot分析该蛋白的免疫学活性.结果表明:pGEX6p-1-ompA以可溶形式表达,蛋白分子量大小为60 kDa,与预计大小相符,纯化的蛋白具有良好的免疫学活性. 相似文献
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为了研制新型细胞因子制剂，将鸡白细胞介素18（ChIL-18）基因和鸡α-干扰素（ChIFN-α）基因通过多肽氨基酸接头（Linker）连接在一起构成mChIL-18／mChIFN-α融合蛋白基因，并构建原核重组表达载体，以期表达具有生物学活性的融合蛋白。以mChIL-18 cDNA与mChIFN—αDNA为模板，通过PCR及PCR重叠延伸技术（SOE）得到mChIL-18／mChIFN-α融合DNA。将回收的DNA克隆于pGEM—TEasy载体，并对其进行了测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的mChIL-18／mChIFN—α融合分子DNA。将所克隆的目的片断亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组质粒pQE30-mChIL-18／mChIFN-α。pQE30-mChIL-18／mChIFN—α的成功构建为研制开发新一代的多功能、多靶点的细胞因子制剂奠定了基础。 相似文献
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奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。 相似文献
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提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术 总被引：1，自引：0，他引：1
昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列，设计合成了1对特异性引物，以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因（1035bp），将其克隆到pET-32a（＋）载体上，构建了原核表达载体pET—HA，表达并纯化了重组蛋白，通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示，表达并纯化的Hpg HA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合，并且可以凝集鸡红细胞。表明，成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体，并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg—HA融合蛋白。 相似文献
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动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor),又称动物个体乳腺表达系统,它属于转基因动物的范畴,其核心内容是通过各种转基因技术,将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因,在动物乳腺组织高效表达,在乳汁中生产目的产品。它是20世纪90年代初才出现的生物技术,通过回收奶就可以提取有重要价值的生物活性蛋白。在一般情况下,这种特异性表达方式更安全、可靠。本文主要简单介绍动物乳腺生物反应器的一些基本情况,以及我国的研究和产业化发展情况。1动物乳腺生物反应器的基本情况1.1定义乳腺生物反应器一般指用重组DNA技术和转基因技术,将… 相似文献
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利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统(AnpeNPV expression vector system)在柞蚕蛹体内分泌表达柞蚕溶菌酶(ApLz),并建立重组蛋白的分离纯化方法。选用柞蚕30 kD蛋白信号肽构建分泌型转移表达载体pApBacDual-N1/L21Ap30kDSP,将Aplz基因克隆至该载体中,重组DNA转化感受态细胞DH10B/AnpeBacΔcc,通过抗生素抗性及蓝白斑筛选获得重组杆粒AnpeBacΔcc/phAplz,并经PCR检测确认。重组杆粒DNA转染Tn-Hi5细胞后得到具有感染性的重组病毒Anpe-NPVΔcc/phAplz。重组病毒感染柞蚕蛹6～7 d后收集柞蚕蛹血淋巴,利用His-tag Purification Resin和StrepTrap HP亲和层析柱对重组ApLz进行两步分离纯化。重组ApLz经SDS-PAGE和Western blot鉴定、蛋白质N端测序分析以及抗菌活性检测,结果显示,重组ApLz可以通过AnpeNPV表达载体系统在柞蚕蛹中得到分泌表达,经过两步层析分离得到的重组... 相似文献
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透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中的高效表达 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因（vgb）克隆到融合表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21（DE3）表达。重组蛋白在30℃诱导获得可溶表达。利用Ni^2＋亲和层析对重组蛋白进行了纯化，得到重组的透明颠菌血红蛋白，蛋白呈红色。实验现象显示重组蛋白与血红索相结合。紫外光区和可见光区波长扫描分析显示：蛋白粗提物和纯化后的血红蛋白在230nm和413nm都有强吸收峰，初步表明，尽管重组蛋白比天然蛋白多36个氨基酸，重组蛋白仍然具有生理活性。诱导后4h和6h的培养液氨基乙酰丙酸含量分别达到17mg／L和21mg／L。说明重组蛋白的表达明显促进了体内heme合成途径。 相似文献
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血凝素是副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum，Hpg）的主要抗原成分之一，鸡只对Hpg的免疫力与血凝素抗体滴度成正相关。根据GenBank上已发表的B型Hpg Dalian株的血凝素基因序列（AY622378），设计合成了1对特异扩增Hpg血凝素基因的引物。以大连分离株Hpg中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增出了1038bp的血凝素基因，将其克隆到pET-32a载体上，构建了pET-HA原核表达质粒并在BL21。大肠杆菌中过量表达。血凝试验显示纯化的重组蛋白具有血凝活性；Western试验证明该重组蛋白可以被B型Hpg特异性鸡血清所识别。本研究在国内首次对Hpg的血凝素基因进行克隆表达，并分析了重组蛋白的血凝活性。 相似文献
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为原核表达具有生物活性的重组前胸腺肽α(proTα),本实验利用人工合成的330 bp proTα DNA编码序列,构建重组表达质粒pET-proTα,将其转化于大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,采用MTT方法测定重组蛋白对小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖的影响。SDS-PAGE结果显示proTα重组蛋白以可溶形式表达,分子量约32 ku。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后获得具有生物活性的蛋白,在体外能够明显促进小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖活性,与轮状病毒共同免疫小鼠能够提高轮状病毒VP6蛋白的特异性抗体水平,并提高抗原刺激下脾细胞分泌IFN-γ水平。本研究首次确认了proTα蛋白在小鼠体内具有佐剂活性,为proTα生物活性的进一步研究及其作为疫苗佐剂的开发奠定基础。 相似文献
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根据GenBank中公布的犬α-干扰素（CaIFN-α）基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a（His标签）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a（His标签）连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
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乳腺生物反应器表达载体和转基因方法的研究概况 总被引：1，自引：0，他引：1
动物乳腺生物反应器，属转基因动物研究的范畴，是指通过各种转基因技术，将某种或几种具有重要生物活性的蛋白外源基因在动物乳腺中高效表达，从而在乳腺中生产目的基因产品。与细胞发酵系统相比，乳腺生物反应器的pH、温度、离子强度等由动物自身控制和平衡，其发酵特性可以遗传，生产效率非常高，而且生产的外源蛋白具有翻译后加工 相似文献
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胎儿弯杆菌表面蛋白(SapA)基因的分段表达及其免疫原性分析 总被引：4，自引：2，他引：2
应用PCR方法扩增出胎儿弯杆菌表面蛋白基因（SapA）的2个基因片段SapA-N（1398bp）和sapA—C（1422bp）,采用DNA重组技术,将2个基因片段分别连接于表达载体pET32a（＋）,并在大肠杆菌中诱导表达（rSapA—N和rSapA—C）,用金属鳌合层析的方法纯化蛋白。以Western blot检测重组蛋白的免疫学活性,ELISA试验分析2种蛋白用于胎儿弯杆菌病血清学诊断的可能性。结果表明,以可溶形式表达的2部分蛋白分子量大小约66ku,与预期大小相符。纯化的蛋白均具有良好的免疫学活性,但蛋白rSapA-N比蛋白rSapA-C的免疫学活性高,rSapA-N具有良好的胎儿弯杆菌病血清学诊断的应用价值。 相似文献
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利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。 相似文献