用套式PCR法检测犬冠状病毒的研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

乔军  孟庆玲  贾桂珍  何宏彬  夏咸柱 《新疆农业科学》2000,37(2):64-67

根据GenBank中Wesseling 发表的犬冠状病毒K378株纤突蛋白基因序列,设计合成了能扩增372 bp 基因片段的套式引物.用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽取法提取细胞总RNA进行反转录,再以此产物进行套式PCR扩增,并筛选出最佳套式PCR扩增条件.结果经套式PCR扩增能得到与设计大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬Ⅰ型腺病毒、狂犬病病毒的核酸.敏感性试验表明,此法能扩增出犬冠状病毒强毒细胞培养物(毒价为10-4.2TCID50/0.1 ml)10-6稀释的反转录产物,远高于常规RTPCR.经初步应用表明,此法可用于犬冠状病毒的临床诊断和实验研究.  相似文献   

用RT—PCR法对猪瘟病毒检测的研究   总被引：4，自引：0，他引：4  

乔军  陈创夫  高丰  贾桂珍 《塔里木大学学报》2001,13(4):25-27

用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物(272bp)，并且不扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸；其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。  相似文献   

犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用     

杨井泉  韩猛立  朱艳平  黄新  薄新文 《新疆农业科学》2011,48(6):1098-1103

[目的]建立一种犬瘟热病毒(CDV) RT-nested PCR检测方法.[方法]根据CDV弱毒株Onderstepoort 的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验.[结果]特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带.敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者.重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同.用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT- nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品.[结论]建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查.  相似文献   

毛皮动物犬瘟热RT-PCR方法的建立与应用   总被引：6，自引：2，他引：6  

王凤雪  闫喜军  邵西群  柴秀丽  姜莉莉  吴威 《特产研究》2005,27(4):14-17

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒（CDV）核衣壳（N）蛋白基因序列，设计合成了1对寡聚核苷酸引物，建立CDV的RT—PCR检测方法。结果表明，该对引物能够从CDV疫苗株和疑似病例RNA反转录产物中扩增出大小为335bp的核苷酸片段，与理论值一致；该方法特异、敏感，检出率高，可用于CDV临床快速检测。  相似文献   

犬细小病毒病的PCR临床诊断研究   总被引：3，自引：0，他引：3  

姚大伟  侯加法  沈向真  杨德吉 《安徽农学通报》2007,13(8):73-75

建立犬细小病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法,并应用于临床诊断.根据犬细小病毒基因保守序列设计一对特异性引物,扩增目的片段大小为448bp.用此引物扩增疫苗中的犬细小病毒和37份病料中的犬细小病毒,并与胶体金诊断试剂盒相对比.实验结果显示:该方法能从疫苗中和临床病料中扩增出犬细小病毒目的基因片段,与胶体金诊断试剂盒相比能克服免疫血清学诊断中的非特异性反应,具有快速、准确、灵敏度高的优点,完全适用于犬细小病毒病的临床诊断.  相似文献   

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立及应用     

修占伍  张颖  胡日新  陈灿  高旭 《吉林农业》2011,(11):195-195

研究根据GenBank发表的犬瘟热病毒（CDV）F基因保守区设计合成一对特异性引物,建立检测CDV RT—PCR方法。结果表明,该方法扩增的产物与预期大小相符,时犬腺病毒、犬细小病毒和狂犬病病毒的扩增结果均为阴性;对倍比稀释的CDV cDNA进行检测,其敏感度可达100 TCID50：对30份CDV疑似病例检出的阳性率为100％,而犬瘟热抗原检测卡检出CDV的阳性率为90％。证明建立的RT—PCR方法特异性强、敏感性高,可用于CDV的检测及分子流行病学调查。  相似文献   

羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用   总被引：2，自引：0，他引：2  

向智龙  程振涛  卓建华  欧德渊  文明  周碧君  尹传宝  吴飞  冯会利  刘芳  冉光鑫  鲜思美 《贵州农业科学》2010,38(7)

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.  相似文献   

鸭出血性卵巢炎病毒RT-PCR检测方法的建立   总被引：5，自引：0，他引：5  

万春和  施少华  程龙飞  陈红梅  傅光华  彭春香  林芳  林建生  黄瑜 《福建农业学报》2011,26(1):10-12

参照(GenBank上登录的黄病毒科黄病毒属Ns5基因片段序列设计引物,建立能检测引起鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR方法.该办法能从鸭出血性卵巢炎病毒扩增出1条约470 bp的特异性片段,从H9亚型禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽Ⅰ型副粘病毒均不能扩增出目的片段;敏感性试验显示建立的RT-PCR...  相似文献   

犬细小病毒巢式PCR诊断方法的建立及应用     

简子健  马素贞  陈胜男  翟少华  赵森 《新疆农业科学》2012,49(1):155-160

[目的]以期建立犬细小病毒巢式PCR诊断方法.[方法]根据基因库已发表的CPV VP2基因序列设计二对巢式引物,以临床上疑似CPV感染的犬粪样品中提取的总DNA作为模板,用巢式PCR方法扩增出CPV VP2基因的目的条带.[结果]扩增出的目的基因与国际标准序列的同源性为99.3;～ 100;.特异性试验发现该引物不能启动犬其它常见病毒基因的扩增.敏感性试验表明该引物能检测到10-9的CPV总RNA量.重复性试验显示该引物具有良好的稳定性.对采集的26份样品进行CPV巢式PCR检测,20份样品为阳性,阳性率为76.9;.[结论]建立的CPV的RT - PCR检测方法可于临床CPV的快速诊断和小规模的分子流行病学调查.  相似文献   

犬瘟热病毒OP株核蛋白基因的克隆与表达   总被引：4，自引：2，他引：4  

宗卫峰  徐向明  杨玲  殷俊  陈璐  李厚达 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2003,24(3):8-11

以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,根据已发表的犬瘟热病毒OP株序列设计两对引物,RT-PCR扩增出核蛋白基因的822、897bp片段。将PCR产物定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,再将重组质粒转化进宿主菌BL_(21)中,在37℃、1.0mmol·L~(-1)IPTG的诱导下,核蛋白基因分段获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达融合蛋白质的相对分子质量分别为52、54ku。将表达产物回收后混合免疫小鼠,间接免疫荧光试验显示免疫小鼠的血清能与病毒感染的细胞呈现特异反应,表明体外表达核蛋白基因保留了天然蛋白部分的抗原性。  相似文献   

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析     

孙雨航  张宏  夏成  吴凌  许楚楚  李昌盛 《黑龙江八一农垦大学学报》2014,26(4):36-39

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。  相似文献   

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析   总被引：5，自引：0，他引：5  

鞠会艳  乔军  高玉伟  杨松涛  夏咸柱 《东北农业大学学报》2010,41(5)

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。  相似文献   

犬瘟热病毒H基因5＇端的表达纯化及抗原性分析     

易立  程世鹏  金卉  王建科  许红丽  杨莘 《特产研究》2011,33(3):6-9

为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。  相似文献   

水貂源犬瘟热病毒的分离鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

苏凤艳  宗春苗  王卓聪  丁庆东  王全凯 《吉林农业大学学报》2006,28(6):674-677

利用Vero传代细胞从病死水貂肝脏中分离获得1株病毒。该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变(CPE)。以提取病毒感染细胞总RNA为模板进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),结果扩增出的基因片段大小与预期值相符。根据病毒的致细胞病变特征和RT-PCR鉴定结果,确证该毒株为犬瘟热病毒。  相似文献   

用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究   总被引：6，自引：0，他引：6  

鞠会艳  夏咸柱  高玉伟  杨松涛  冯娜  王铁城  李彦舫 《吉林农业大学学报》2006,28(3):317-320

利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,利用N基因引物也从同样的7份病料中扩增出586 bp的核酸片段。其余病料的检测结果为阴性。2对引物对病料的检测结果一致。  相似文献   

混合培养基用于提高犬瘟热病毒在细胞上的效价研究     

王光明  张茂林  关振宏  杨盛华  张俊辉 《安徽农业科学》2011,39(14):8638+8641-8638,8641

[目的]探讨高滴度制备犬瘟热病毒（CDV）的方法,对于提高该疫苗的保护率具有重要意义。[方法]选用FK81细胞,分别应用MEM和混合培养基（MEM和DMEM按9∶1的混合物）进行细胞培养和CDV接种,然后对2种培养基下的总细胞数、CDV的半数细胞感染量（TCID50）及电镜下病毒粒子的形态等进行了比较。[结果]混合培养基在总细胞数、TCID50及病毒粒子的形态方面均优于MEM培养基。同时还发现,在测定CDV的TCID50时,酶联免疫吸附试验（ELISA）法较细胞病变（CPE）法更灵敏。[结论]试验所建立的CDV增殖方法,可望用于犬瘟热疫苗的生产实践。  相似文献   

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定   总被引：3，自引：0，他引：3  

申卫红  马素贞  陈胜男  刘腾飞  陶玉成  简子健 《新疆农业大学学报》2010,33(2):137-141

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。  相似文献   

貂、貉源犬瘟热病毒流行毒株H基因的克隆及遗传多样性分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

张维  王君玮  李林  赵永刚  任炜杰  王志亮 《吉林农业大学学报》2010,32(1):75-80

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)毒株的变异特性,对分离自不同地区貉、貂的5个CDV毒株和1个CDV国内弱毒疫苗株(vacChina)的H基因进行了核苷酸测序,并与12个参考毒株构建系统发生树。结果表明:5个流行毒株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,vacChina与5个流行毒株的H基因核苷酸序列同源性普遍较低(90.5%～91.8%),而与国外疫苗株Convac和Onderstepoort的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%。流行毒株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100.0%),流行毒株与vacChina疫苗株H蛋白氨基酸同源性普遍较低(89.7%～91.8%),vacChina与Onderstepoort、Convac有着很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%、95.6%。结果分析显示,CDV的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。  相似文献