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1.
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
2.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(1)
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
3.
[目的]建立一种检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[方法]从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上酶切回收ORF2基因的羧基端部分ORFc片段,克隆到pGEX-6P-1表达载体上,构建原核表达质粒pGEX-ORFc,转化入大肠杆菌BL21进行原核表达,用Western-blot法检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,从而建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。[结果]重组表达质粒的酶切鉴定证明已成功构建重组表达质粒pGEX-ORFc,其在E.coliBL21中诱导5、6 h时表达效果最好。纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致均在40.0 kD处,证明重组蛋白得到良好纯化。试验确定抗原最佳包被浓度为12.85μg/m l,血清稀释度为1∶40。3次重复检测表明,变异系数最大为7.12%。[结论]建立的ELISA方法对检测PCV2感染具有良好的特异性及重复性。 相似文献
4.
利用可溶性重组PCV2-Cap蛋白肽段为抗原,建立PCV2血清抗体间接ELISA诊断方法(rhcap-ELISA)。将PCV2cap基因中含主要表位的片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至18℃诱导,获得大小为34 ku的可溶性融合蛋白。Western blotting试验证实该融合蛋白具有很强的免疫学活性,通过亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化。用融合表达的可溶性蛋白肽段作为抗原,建立猪圆环病毒(PCV2)血清抗体间接ELISA诊断方法。该方法的交叉反应结果表明,重组抗原与PRRSV、CSF、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rhcap-ELISA和商品化的同类试剂盒(PCV2-Ab-Kit)检测137送检血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为79.56%和83.21%。因此,rhcap-ELISA猪圆环病毒抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合于在大规模的PCV2血清抗体的检测工作中使用。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物（重组N蛋白）进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化（如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等）,确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。 相似文献
6.
葛猛 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2013,39(1):63-68
为建立检测PCV2抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，将猪圆环病毒2(porcine circovirus type 2，PCV2)结构蛋白Cap(不含核内化信号肽)的基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中，并在大肠杆菌中表达，获得可溶性的重组蛋白(Cap⊿41)，用Cap⊿41作为诊断抗原，确立了间接ELISA的最佳反应条件，并对来自4个猪场的394份血清进行检测。结果表明，与免疫荧光检测相比，建立的间接ELISA的检测敏感性和特异性分别为93.14%和95.72%，且建立的间接ELISA的批内与批间差异较小。此外，对394份血清的检测结果体现的4个猪场的PCV2抗体消长规律与临床结果相符，表明建立的间接ELISA方法可靠，可以用于PCV2抗体的检测。 相似文献
7.
猪圆环病毒2型的血清学检测 总被引：2，自引：1，他引：1
以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(His-CAP2)为抗原,通过方阵ELISA滴定,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg·mL-1,待检血清稀释度为1:40,建立PCV2的血清流行病学的间接ELISA监测方法.通过对已知PCV2血清及其他病毒血清的试验,表明该ELISA方法具有良好的特异性.利用该方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行检测,PCV2抗体阳性检出率为70.29%,与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况相符合,证实了此方法临床应用的可行性. 相似文献
8.
为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。 相似文献
9.
【目的】建立一种适用于PPRVN蛋白抗体的间接ELISA检测方法,应用于PPR防疫.【方法】根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,设计1对特异引物对N5基因扩增,经测序分析后将N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,成功构建pET-32a-N5质粒.将pET-32a-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,重组蛋白分析具有良好的反应原性.【结果】利用原核表达纯化的PPRV N重组蛋白作为包被抗原,初步建立了一种能够检测针对PPRV N蛋白抗体的间接ELISA方法.用建立的方法对112山羊份血清进行了抗体检测,该方法与竞争ELISA试剂盒对比,临床符合率94.8%.【结论】该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性. 相似文献
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【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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本研究克隆、原核表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白。根据新分离毒株PCV2-871的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去掉核定位信号的ORF2基因,命名为pcv-581,利用引入的双酶切位点BamHI/HindⅢ将其连接到表达载体pQE-32中,命名为pQE-pcv581转化大肠杆菌M15中,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE鉴定,发现去核定位信号的ORF2片段可以大量表达。 相似文献
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猪瘟病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
以猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)标准强毒石门株为模板,RT-PCR扩增CSFV E2基因N端的主要抗原区(△E2).PCR产物定向克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-AE2,转化Eacterium coli BL21-Codonplus(DE3),IPTG诱导重组△E2蛋白表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达.KCl预染切胶法纯化△E2蛋白,以其为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了CSFV抗体ELISA检测方法.用该方法对331份临床血清进行检测,并与IDEXX公司阻断ELISA试剂盒进行了相符性验证,符合率为74%.为研制猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础. 相似文献
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为获得猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白单克隆抗体,将516 bp的ORF2基因片段克隆入pET-28a(+),转化入大肠杆菌,在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,叠加ELISA方法检测两株单克隆抗体识别的抗原表位关系。SDS-PAGE和Western blot结果表明重组蛋白ORF2得到高效表达;筛选获得两株稳定分泌抗ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3H3和3F2,其分泌的单体均为IgG1亚型;且均具有较高的特异性和敏感性;叠加ELISA显示,两株单克隆抗体识别不同的抗原表位。本研究制备的单抗有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速准确诊断方法的建立提供了平台。 相似文献
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用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。 相似文献
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利用PCR方法扩增猪圆环病毒2型核定位信号区缺失的Cap蛋白基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.将此融合片段亚克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-gp64-dCap.然后将含有CMV启动子,gp64及dCap的基因片段克隆到杆状病... 相似文献
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将大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)基因eltb克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21/DE3/plyss。采用SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明,在大肠杆菌中高效表达了LTB蛋白,其产量约为细菌总蛋白的20%,GM1-ELISA方法鉴定目的重组蛋白可与GM1结合,具有潜在的佐剂活性;由纯化的重组蛋白免疫小鼠制备的抗血清效价为1:16000,并且可以特异性识别天然毒素。结果表明,所表达的LTB有良好的抗原性和佐剂活性,制备的抗血清具有良好的免疫活性,为下一步以LTB作为佐剂的黏膜疫苗研究提供基础材料。 相似文献