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1.
微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法.经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25 μg/孔,被检血清稀释度为1:200,酶标二抗稀释度为1:2000,封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液.该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性.该方法灵敏度为1:1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查. 相似文献
2.
原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。 相似文献
3.
旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。 相似文献
4.
基于口蹄疫病毒非结构蛋白3AB/2C的ELISA鉴别检测试剂盒的研制与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《畜牧与兽医》2016,(11):71-76
基于口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB/2C,研制快速鉴别口蹄疫自然感染和疫苗接种的ELISA检测试剂盒。诱导表达3AB/2C蛋白,His亲和层析纯化目的蛋白;以纯化的3AB/2C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法,优化ELISA反应条件;标准化ELISA操作规程和试剂盒组分,组装ELISA试剂盒,进行特异性、敏感性、符合率、重复性、血清交叉反应、保存期等性能评价;分离临床牛血清进行应用性检测,评价ELISA试剂盒适用性。结果获得了大小约51 ku可溶性表达3AB/2C蛋白,亲和层析纯化后纯度可达90%以上;确定最适抗原包被浓度为3.25μg/m L,血清稀释度1∶80,封闭液为2%乳清蛋白,封闭条件为37℃1 h 4℃10 h;试剂盒敏感性97.5%、特异性98.3%,批内、批间变异系数分别为3.40%~6.71%和5.20%~8.44%;与3种商品化试剂盒符合率分别为98.90%、98.02%和96.72%;试剂盒4℃条件下保存期可达12个月;1 457份临床样品检测,FMDV感染阳性率6.41%~30.35%。本研究研制的鉴别ELISA试剂盒检测结果可靠、稳定性好,能有效鉴别FMDV自然感染和疫苗免疫,可为FMD综合防控提供技术支撑。 相似文献
5.
旨在调查青海省大通县部分地区世居牦牛犊隐孢子虫的感染情况及其虫种类型。在大通县宝库乡和良教乡采集了200份3~5月龄世居牦牛犊粪样进行隐孢子虫检测。所有样品经蔗糖密度梯度离心法纯化处理,采用免疫荧光试验（IFT）方法进行检测,阳性样品再用套式PCR扩增18S rDNA,并进行测序和同源性分析以供虫种鉴定。结果表明：免疫荧光试验（IFT）方法镜检出3份隐孢子虫阳性样品,阳性率为1.5%（3/200）;阳性样品经套式PCR扩增18S rDNA后,有2份隐孢子虫样品呈阳性,扩增产物长度为500 bp,测序后将序列命名为QHDTC201901和QHDTC201902;系统发育分析显示,种类鉴定发现2种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）和牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis）,总感染率为1.0%（2/200）。综上提示,大通县部分地区牦牛犊存在隐孢子虫感染,感染虫种为安氏隐孢子虫和牛隐孢子虫。该调查研究为该地区牛隐孢子虫病的防控提供了临床基本数据。 相似文献
6.
为建立1种禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)抗体检测方法,试验对AEV VP1蛋白进行截短表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测AEV抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组VP1蛋白以包涵体形式表达,大小为34 kDa;可与AEV阳性血清发生特异性反应;以VP1蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测ALV、IBDV、IBV、ILTV、NDV、AIV-H9阳性血清均为阴性;检测AEV抗体的最低检出效价为1∶51 200;与IDEXX试剂盒的符合率为95.24%;检测新疆地区1 127份AEV疫苗免疫鸡血清样品和879份未免疫鸡血清样品的免疫抗体阳性率和感染抗体阳性率分别为88.91%和8.19%。结果表明,建立的间接ELISA方法特异、敏感、准确,可用于临床中免疫抗体和野毒感染抗体的检测和筛查。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2015,(11):1792-1798
RT-PCR扩增华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的Enolase基因后,进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物;以纯化后的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对工作条件进行优化。结果表明,ELISA最佳工作条件为:抗原最佳包被质量浓度为5mg/L,37℃1h再4℃过夜;5%脱脂奶粉,37℃封闭1h;待检血清1∶100稀释37℃孵育1h;酶标二抗1∶5 000稀释,37℃孵育45min;TMB显色作用时间10min;确定的阴阳性血清临界值为0.253。所建立的ELISA方法特异性较好,可检测犬华支睾吸虫病阳性血清,与犬卫氏并殖吸虫病阳性血清、犬蛔虫病阳性血清、犬弓形虫病阳性血清、犬新孢子虫病阳性血清均不发生反应。该方法敏感性为1∶3 200。批间批内重复性试验变异系数均小于10%。在临床应用中,对浙江地区353多份犬血清的检测表明,样品阳性率为1.13%。本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为华支睾吸虫的血清流行病学调查提供了有效手段。 相似文献
8.
为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。 相似文献
9.
为建立胞内劳森菌特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的胞内劳森菌表面蛋白LsaA的编码基因克隆于pET32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的重组LsaA蛋白作为包被抗原,通过一系列条件优化,建立了检测胞内劳森菌抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法可以特异地检测抗胞内劳森菌抗体,与大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等常见猪腹泻病原的抗血清均无交叉反应。来自PCR检测粪便呈胞内劳森菌阳性猪的血清,用所建立ELISA检测均为胞内劳森菌抗体阳性。该方法具有较好的敏感性和重复性,阳性血清经过1∶800稀释检测结果仍为阳性,批内和批间重复试验的变异系数分别为0.352%~2.752%和0.877%~3.000%。应用建立的ELISA方法对河南省部分地区猪场胞内劳森菌的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区猪场均存在不同程度的胞内劳森菌抗体阳性,阳性率在13.3%~57.1%,平均阳性率为30.6%。结果表明,本研究所建立的ELISA方法可以用于胞内劳森菌抗体的检测,为胞内劳森菌感染的监测和流行病学调查提供了方法。 相似文献
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为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。 相似文献
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猪圆环病毒2型IgM抗体间接ELISA的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要原发性病原,其感染的早期检测有助于及时采取防控措施。以重组衣壳蛋白(Cap蛋白)作为包被抗原,通过对反应条件的优化,建立了PCV2 IgM抗体间接ELISA,其最适抗原包被浓度为1.25 μg／mL,最适血清稀释度为1∶100,临界值为0.35。该检测方法与其他5种常见猪疫病阳性血清无交叉反应,特异性良好。批内、批间重复试验的变异系数均在2%~6%,重复性好。对100份临床样本的检测结果表明,该检测方法与国外同类试剂盒相比,敏感性为90.3%,特异性为92.8%,总符合率为92%。试验结果表明,所建立的PCV2 IgM间接ELISA特异性好和敏感性高,适用于PCV2感染早期的流行病学调查。 相似文献
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将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。 相似文献
14.
《中国兽医学报》2019,(12):2350-2355
以筛选马梨形虫地方虫株EMA和Bc48基因最佳抗原蛋白建立间接ELISA检测方法及其临床应用研究为目的,对已构建保存的pGEX4T-1/EMA1、PET-28a/EMA1、PET-28a/EMA2、PET-28a/EMA3、pGEX4T-1/Bc48和PET-28a/Bc48质粒进行优化表达,经KCl方法切胶纯化后作为间接ELISA包被抗原,经表达量、特异性、敏感性、重复性、符合性试验验证,筛选最佳重组抗原蛋白,优化、建立间接ELISA检测方法,并用于临床样品(n=1 584)的抗体检测。结果显示,筛选出的最佳重组抗原蛋白为GST-EMA1和His-Bc48,其可溶性蛋白表达量相比之下较高;以GST-EMA1、His-Bc48蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA可明显区分马梨形虫标准阴性和阳性血清;阳性血清梯度效价可达1∶800;批内重复率分别为96%和94%;与商品化cELISA试剂盒检测结果的符合率为96%。所检测的血清样品中,新疆昭苏、米泉、富蕴、阿克苏及和静样品混合感染率分别为2.27%,6.90%,1.72%,0.74%和1.18%;不同年龄马匹之间感染存在显著性差异(P=0.0000.05)。试验筛选出GST-EMA1、His-Bc48为最佳抗原蛋白,经临床试验验证所建立间接ELISA检测方法的特异性强和灵敏度高,为后期马梨形虫病血清学诊断用间接ELISA商品化试剂盒研制提供实验材料和技术支持。 相似文献
15.
《中国畜牧兽医》2018,(12)
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 相似文献
16.
《中国动物传染病学报》2016,(2)
本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件:抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1:200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1:40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD_(450)≤0.255和OD_(450)≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD_(450)值的批内变异系数为1.97%~7.85%,批间变异系数为1.94%~6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。 相似文献
17.
《养猪》2021,(5)
为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。 相似文献
18.
为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。 相似文献
19.
《中国兽医学报》2016,(11):1813-1817
为建立检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)血清抗体的间接ELISA方法,构建了高效表达PHEV核衣壳蛋白(N)的重组质粒(pET28a-N),Western blot检测该重组蛋白具有较好的免疫原性。以纯化的N重组蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2mg/L,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶10 000,建立了用于PHEV抗体检测间接ELISA方法。此外,用该法(N-ELISA)对天津市地区采集到的200份猪血清样品进行检测,阳性检出率为83.5%,与前期工作中建立的全病毒作为包被抗原的间接ELISA诊断方法 (HEV-ELISA)检测结果的符合率为90.91%。结果表明:以重组N蛋白为包被抗原所建立的用于PHEV血清抗体检测的方法能够用于检测PHEV感染及相关的流行病学调查。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。 相似文献