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为建立脂质体介导的高效体细胞转染体系,采用脂质体TransfastTM包裹编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pCMV-EGFP质粒,转染5～13代山羊胎儿成纤维细胞,并用流式细胞仪检测不同DNA剂量、细胞汇合度、血清、转染时间及脂质体与DNA比例等参数对转染效率的影响。实验发现0.75μgDNA按1∶1的脂质体与DNA比例,在无血清条件下转染汇合50%细胞3h,转染效率最高可达40.7%±5%。4h转染时间、细胞汇合80%及转染体系中有血清会降低转染效率。随着DNA剂量的增加,转染效率呈剂量依赖性增高,但山羊成纤维细胞的活细胞数显著下降。实验表明TransfastTM能高效安全地介导外源基因转染山羊成纤维细胞。 相似文献
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首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。 相似文献
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带有绿色荧光蛋白外源DNA转染绵羊成纤维细胞的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500 μL转染培养基中成纤维细胞达到85%汇合时,添加由50 μL DMEM中含有0.2 μg DNA和50 μL DMEM中含有2.0 μL LipofectamineTM 2000的两种溶液混合构成的转染液并转染12 h,可获得最高的转染效率。当转染12 h后,用基础培养液培养至第24小时,细胞核周区出现强绿色荧光,而当转染后48～64 h观察时,细胞核周区的荧光强度明显弱,而远离核周区的胞质中的荧光强度增加。 相似文献
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用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。 相似文献
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《中国畜牧杂志》2021,(8)
实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据。利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平。结果表明:随着水牛年龄增长,原代成纤维细胞扩展速度不断下降,P2代细胞的生长曲线呈典型的S型,3月龄胎儿水牛成纤维细胞的增殖能力均高于新生水牛和10岁龄水牛(P0.05);3月龄胎儿水牛与新生水牛的DNA甲基化水平低于10岁龄水牛(P0.01),3月龄胎儿水牛成纤维细胞的DNA甲基化转移酶基因DNMT1、DNMT3A低于新生水牛和10岁龄水牛(P0.01);随着年龄增长,水牛成纤维细胞组蛋白乙酰化转移酶HAT1基因的表达降低(P0.01),组蛋白去乙酰化酶HDAC1基因的表达升高(P0.01)。以上结果说明,水牛胎儿成纤维细胞处于低DNA甲基化高组蛋白乙酰化状态,可能更适合作为供体细胞用于水牛体细胞克隆研究。 相似文献
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试验旨在比较腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的效率。将腺病毒质粒pBHGloxdelE13cre、pDC316-eGFP脂质体转染293细胞,收集病毒并测定病毒滴度。用腺病毒载体按不同的感染复数（MOI）感染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞,72 h后倒置荧光显微镜下观察,统计感染效率。MOI为25、50、100、200、400时,成纤维细胞感染效率分别为0.7%、7.0%、9.0%、12.5%、34.0%,卵丘细胞感染效率分别为42.5%、55.3%、57.4%、76.0%、80.0%,乳腺上皮细胞感染效率分别为88.7%、100%、100%、100%、100%。结果表明,腺病毒转染乳腺上皮效率最佳,卵丘细胞次之,成纤维细胞效果较差。 相似文献
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Fat-1基因能协调ω-6多聚不饱和脂肪酸与ω-3多聚不饱和脂肪酸之间的比例,可提高动物体ω-3多聚不饱和脂肪酸的含量,为提升水牛乳品质提供了一个有效的方法。本研究构建了水牛乳腺特异性多位点基因打靶载体,分离和培养了新生胎儿水牛肾脏成纤维细胞。采用电击法转染、克隆环法筛选和纯化了水牛肾脏成纤维细胞克隆,经绿色荧光蛋白表达观察、PCR和DNA序列检测获得了已整合Fat-1基因的细胞克隆,为制备定点整合Fat-1基因的体细胞克隆水牛提供核移植供体。 相似文献
9.
为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。 相似文献
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本试验对水牛胚胎生殖干细胞饲养层体系建立进行了研究。首先比较了组织块法和酶消化法培养水牛胎儿成纤维细胞的差异;其次探讨丝裂霉素处理水牛胎儿成纤维细胞的有效时间;最后以建立的饲养层体系培养水牛胚胎生殖干细胞。结果表明：（1）组织块法培养的细胞状态优于酶消化法,组织块培养法更适于水牛胎儿成纤维细胞的分离培养;（2）第三代的水牛胎儿成纤维细胞核型正常,状态良好,可用于饲养层的制备;（3）通过MTT和Brdu法检测,确定10mg／L的丝裂霉素C处理水牛胎儿成纤维细胞3．5h能有效抑制成纤维细胞增殖且细胞形态良好;（4）在本试验条件下制备的饲养层能有效维持水牛胚胎生殖千细胞至8代。 相似文献
11.
低转染效率一直是利用基因转染技术研究柔嫩艾美耳球虫的主要屏障。为了进一步提高现有的转染效率,本研究分别利用传统的Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪和新型的NucleofectorⅠ核转仪对柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染条件进行了优化。通过对外源DNA浓度、电场强度、环境温度及NucleofectorⅠ核转仪的内置程序这些关键参数的探索,最终发现利用Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪设置电压为2000 V,电容25 μF,利用4 mm电击杯进行电转时,转染效率最高,达到3.8×10-4,此时最佳质粒浓度为50 μg/107子孢子。 相似文献
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山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。 相似文献
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电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究 总被引：12，自引：0，他引：12
本文应用质粒pEGFP Cl带有水母绿色荧光蛋白 (GFP)基因和新霉素抗性基因 (Neor)两种报告基因转染胎儿成纤维细胞 ,进行转染条件优化。首先 ,通过成活率确定转染脉冲时程和场强 ,发现有三种组合是最适的组合 ,它们分别为 :时程 5ms,场强 1.2 5～ 1.5kV/cm ;时程 15ms时 ,场强 1.0～ 1.2 5kV/cm ;时程 2 5ms时 ,场强 0 .75～ 1.0kV/cm。接着采用场强 1.2 5kV/cm ,时程 15ms ,研究转染的温度、电导介质、细胞状态、DNA用量和细胞密度对转染效率的影响 ,结果表明电导介质为Dhanks,DNA用量为 4 μg/mL ,对数期细胞密度为 1× 10 6～ 1× 10 7个 /mL ,电击前后在 4℃下各静置 10min时 ,能获得最佳转染效率。 相似文献
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以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明：在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1．2μg／μL的质粒,在电场强度和脉）中时间分别为10kV／cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2．6×10^4CFU／μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。 相似文献
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Blanton JR Bidwell CA Sanders DA Sharkey CM McFarland DC Gerrard DE Grant AL 《Journal of animal science》2000,78(4):909-918
Cell-mediated gene transfer is a potential tool for studying muscle growth, but efficient genetic manipulation and implantation strategies have not been developed for pigs. The objectives of the present study were to determine methods for transient and stable incorporation of reporter genes into porcine muscle cells and to investigate their use for cell-mediated gene transfer in pigs. Porcine myoblasts and fibroblasts were isolated from muscle of 2-wk-old male pigs. Myogenic cell lines were identified using muscle-specific monoclonal antibodies, myotube fusion assays, and the presence of muscle-specific markers (MyoD and desmin). Four commercial cationic liposomes (lipofectAMINE, lipofectin, cellFECTIN, and DMRIE-C) were tested at different DNA:lipid ratios for their ability to transfect myoblasts and fibroblasts transiently with a luciferase reporter plasmid. LipofectAMINE resulted in the greatest (P < .01) transient luciferase activity for both cell types. Electroporation of cells for transient transfection resulted in less luciferase activity than cationic transfection. Stable transfections were conducted using a green fluorescence protein (GFP) reporter plasmid containing the neomycin resistance gene. LipofectAMINE transfection resulted in stable GFP expression in 1:16,000 myoblasts and 1:33,000 fibroblasts. Stable electroporation resulted in efficiencies that were significantly lower than established with cationic liposomes. Porcine cells were transduced with GFP using vesicular stomatitis virus glycoprotein G pseudotyped retrovirus and resulted in efficiencies of 1:1.2 for myoblasts and 1:1.1 for fibroblasts. These results show that cationic liposomes are superior to electroporation for transfection, but retroviral transduction produced stable reporter gene expression in > 80% of porcine muscle cells. Transduced GFP-positive cells were separated from GFP-negative cells by fluorescence-activated cell sorting and implanted into 2-wk-old male pigs. On d 4, implanted muscles were removed and subjected to immunodetection of GFP protein. Fibroblast implantation resulted in limited GFP expression within muscle, whereas myoblast implantation resulted in GFP within muscle fibers. This suggests that cell-mediated gene transfer is possible in porcine muscle and may be useful as an approach for studying muscle growth in pigs. 相似文献
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阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究 总被引：1，自引：0，他引：1
阳离子脂质体转染家蚕培养细胞是家蚕基因功能研究的重要技术之一。利用阳离子脂质体Lipofectamine2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]转基因表达载体,对家蚕卵巢细胞BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21进行了外源DNA质量、脂质体用量、转染细胞密度和转染孵育时间等4个转染条件的优化实验,筛选到了阳离子脂质体转染效率最高的细胞系BmN-SWU1。BmN-SWU1细胞的最佳转染条件为:外源DNA0.6μg,脂质体2.5μL,细胞密度1×105mL-1,无血清条件下孵育24 h。此条件下转染效率可达55.08%。用抗生素G418筛选转染后的BmN-SWU1细胞,建立了GFP转基因细胞系。 相似文献
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试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。 相似文献
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以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。 相似文献
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This study aimed to evaluate different nucleic acid preparations as cytokine inducers in equine cells. To induce cytokine production, bacterial plasmid DNA or short synthetic oligodeoxyribonucleotides (ODN), with or without the transfection reagent lipofectin, were added to cultures of purified equine peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Cytokine activity was detected with bioassays in cell culture supernatants after 24h of induction and cytokine mRNA expression was detected using RT-PCR at 6h post induction. For IFN-alpha/beta it was found that both plasmid DNA and phosphodiester ODN, containing an unmethylated CpG-motif, were able to induce IFN production in the presence of lipofectin but not without. The levels of IFN varied with individuals and were often quite low. Moreover, methylation or removal of the CpG sequence completely abolished IFN induction. CpG-containing ODN with poly-guanine (G) sequences in the 5' and 3' ends induced considerably higher levels of IFN, especially when the poly-G sequences had a phosphorothioate backbone. ODN with poly-G sequences also had the ability to induce IFN in the absence of lipofectin but the levels of IFN induced were radically reduced compared to those induced with lipofectin. In contrast to IFN, which was only detected upon induction, low spontaneous IL-6 production was observed in unstimulated control cultures. Nevertheless, plasmid DNA and CpG-containing ODN were able to increase the IL-6 production threefold. All the IFN inducing ODN also induced IL-6 production and the levels of IL-6 induced seemed influenced by addition of lipofectin and presence of poly-G sequences in the same way as was observed for the IFN-production. However, a complete phosphorothioate ODN with a central CpG-motif and poly-C sequences, that did not induce IFN, readily induced IL-6 both in the presence and absence of lipofectin. In addition, there was also evidence that some ODN induced increased expression of IL-12p40 mRNA. To conclude, equine PBMC were able to recognize CpG-DNA and respond with both IFN-alpha/beta and/or IL-6 production. The levels of cytokine induced, and sometimes which cytokine induced, varied with, e.g., CpG-motifs used, the presence of poly-G sequences, ODN backbone chemistry and presence of lipofectin. 相似文献