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为了建立1种快速简便的羊泰勒虫检测方法，试验根据羊泰勒虫MPSP基因设计2组引物，建立羊泰勒虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法，利用该方法分别检测羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体的DNA。结果：LAMP方法检测羊泰勒虫的结果为阳性，其他虫体均为阴性，具有较好的特异性；对羊泰勒虫DNA最低检测量为1.9×10-9 ng/μL,是PCR方法的100倍。分别利用LAMP、PCR检测30份疑似羊泰勒虫感染病例，LAMP方法阳性检出率为20%(6/30),PCR方法阳性检出率为16.67%(5/30),LAMP方法准确率高于PCR方法。结论：建立的羊泰勒虫可视化LAMP检测方法特异性好、准确率高，可作为羊泰勒虫病诊断的检测方法。 相似文献
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牛附红细胞体LAMP检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快捷、灵敏的牛附红细胞体检测方法,本研究根据GenBank上发表的16S rRNA基因(登录号:AF016546)序列设计合成2对LAMP特异引物,建立了检测牛附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。LAMP扩增产物经电泳、显色鉴定。结果显示,LAMP方法扩增牛附红细胞体产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光;敏感性检测最低浓度为25.6 fg/μL;特异性试验结果显示,牛附红细胞体检测管显色后呈阳性,而猪附红细胞体、牛新孢子虫、弓形虫及牛瑟氏泰勒虫等对照组均呈阴性,说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛附红细胞体的检测。 相似文献
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本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。 相似文献
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《中国兽医杂志》2017,(6)
为建立特异、敏感、快速的羊泰勒虫病诊断方法。根据Gen Bank已报道的羊泰勒虫表面蛋白基因(AY274329)设计合成了1对引物,通过条件优化,建立了羊泰勒虫病二温式PCR诊断方法。该方法能扩增出335 bp的羊泰勒虫特异性基因片段,测序结果与已知基因序列同源性为100%。对羊泰勒虫基因组DNA的最小检测量为16 fg/μL,与新孢子虫、弓形虫、巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫均无交叉反应。与普通PCR相比,二温式-PCR在敏感性方面无显著差异,但其反复升温降温时间消耗短。结果表明,二温式PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性,可用于羊泰勒虫病的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
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牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。 相似文献
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根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献
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目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列,找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段,设计套式PCR两对引物,以UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板,初步建立了检测两种虫体的Nested PCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中,经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested-PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增,长度分别在800~900 bp、400~500 bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高,弓形虫和新孢子虫分别达99.1%、97.2%,但它们两者之间差异较大,同源性仅为86.6%。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点,挑选内切酶进行RFLP实验,结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vsp1酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验,实验证明该Nested PCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增,而对其它原虫基因未能扩增出任何片段;该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子/g猪肉。结论本实验建立Nested PCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫,而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。 相似文献
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基于Nc-5基因的新孢子虫病PCR诊断方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank上登录的犬新孢子虫Nc-5基因序列(AF061249),利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物,以牛源犬新孢子虫吉林株DNA为模板建立了PCR诊断方法。结果显示:建立的PCR方法扩增片段大小为608 bp,克隆基因测得序列与美国株(AF061249)同源性为99%;该方法扩增不出弓形虫、牛瑟氏泰勒虫等基因片段;扩增样本DNA含量为26.5 fg,具有较好的特异性和敏感性;应用建立的PCR方法与环介导等温扩增(LAMP)进行比较,其阳性符合率达100%。说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、快速等优点,完全适用于新孢子虫病的诊断。 相似文献
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Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a simple method that can amplify DNA with high specificity, sensitivity, and rapidity. In this study, we compared the performance of LAMP and real-time PCR assays for diagnosis of toxoplasmosis. We designed a real-time PCR assay targeting a 529 bp element repeated 200-300 times in the Toxoplasma gondii genome. The detection limits of the LAMP and real-time PCR assays were 10 fg/μL and 1 fg/μL of T. gondii DNA, respectively. Conventional PCR, LAMP, and real-time PCR methods were applied to detect T. gondii DNA in blood samples from 284 pigs and 292 sheep. Positive results were obtained with 0.4%, 3.2%, and 4.2% of the pig samples and 3.8%, 17.1%, and 17.8% of the sheep samples with conventional PCR, LAMP, and real-time PCR analyses, respectively. The real-time PCR assay provided the most sensitive diagnosis of toxoplasmosis, but the LAMP assay has potential as an alternative tool for detection of T. gondii in the field. 相似文献
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The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 101 CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method 相似文献
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环介导等温扩增技术在病原检测中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
文章介绍了环介导等温扩增技术的的基本原理、特点及其在传染性疾病中检测和诊断的应用。环介导等温扩增技术具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。环介导等温扩增技术已经被用来快速诊断动物的传染病。目前可检测圆环病毒2型、鹅细小病毒、伪狂犬病病毒、高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、副猪嗜血杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、猪肺炎支原体及弓形虫基因等。 相似文献
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本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。 相似文献
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根据已发表的弓形虫529 bp高拷贝序列,设计特异性引物和探针,建立TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测方法。将该方法用于360份临床样本的检测,并与常规PCR和环介导等温扩增(LAMP)技术进行对比分析。结果表明:Real-time PCR检测的阳性率(11.11%)高于LAMP(7.5%)和常规PCR(3.61%)。采用本实验室建立的Real-time PCR,对收集于不同地区4种动物的750份临床样本检测发现,不同种类动物血液样本中均可检测到弓形虫感染,其中羊的感染率最高(17.8%),猪次之(4.22%),牛较低(1.98%),犬最低(1.37%)。 相似文献
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犬附红细胞体PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
目的 步建立犬附红细胞体PCR检测方法。方法 据已发表的附红细胞体基因序列，设计了一对特异性引物，以犬附红细胞体基因组DNA和附红细胞体可疑病犬样品DNA为模板，聚合酶链式反应（PCR）扩增，扩增产物经克隆测序分析。结果 CR扩增产物大小为541bp，序列分析表明与GenBank数据中发表的序列一致，表明这套引物成功扩增出目的基因序列，但正常犬血样品DNA和弓形虫、伊氏锥虫、吉氏巴贝斯虫、犬细小病毒、犬瘟热的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论 研究建立的PCR方法可以用于犬附红细胞体的检测，为犬附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。 相似文献
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LI Jia-wei GUO Li YANG Yong WANG Jian-ke ZHANG Shu-qin ZHANG Jia-li CHENG Shi-peng 《中国畜牧兽医》2015,42(12):3111-3118
Since the 5'UTR gene (GenBank No.:AY278459.1) had 4 isolated regions,we designed a set of 4 LAMP primers to specifically recognize target gene sequences.This study developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detecting BVDV,using the pyrophosphate magnesium white precipitate for Real-time detection in LAMP reaction process of turbidity instrument,Real-time monitor liquid turbidity to determine result.The whole reaction lasted only 50 minutes at a constructed temperature of 63 ℃ to evaluate specificity,sensibility and repeatability of the method.The result demonstrated that the LAMP assay could only react with BVDV,its specificity was high;It could detect at least 10-6-fold diluted samples,which was 100 more sensitive than PCR assay;And repeatability was good.The simple,rapid,high siensitivity and specificity LAMP assay was a potential tool for the detection of BVDV in field conditions. 相似文献
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LUO Ya-kun LIANG Lin WANG Jing LIU Cun LIU Qi LIU Chang LIN Wen-cheng CUI Shang-jin 《中国畜牧兽医》2017,44(2):344-349
This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples. 相似文献
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针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5'UTR基因(GenBank登录号:AY278459.1)序列设计4条特异性环介导等温扩增 (LAMP) 引物,特异性识别靶基因序列上4个独立区域,采用LAMP技术,利用实时浊度仪实时检测LAMP 反应过程中所产生的焦磷酸镁白色沉淀,实时监测反应液浊度来判断反应结果,实现对扩增反应全过程的监控,建立BVDV的LAMP快速检测方法。通过实时浊度仪在恒温63 ℃下50 min完成检测,对方法的特异性、灵敏度、重复性进行了评价。结果显示,经优化该方法只检测BVDV阳性,特异性强;病毒10-6倍稀释时仍能被检测到,比PCR方法灵敏度至少高100倍;重复性良好。LAMP实时浊度法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优势,为BVDV的临床检测提供了一种简单快速的试验手段。 相似文献