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1.
为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1 061 bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp,NcSRS2-NcGRA7融合基因扩增片段大小为1 482 bp;获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确;测序分析表明,与Gen-Bank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%;经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7融合蛋白抗原指数较高,融合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中2种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。本试验为牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合蛋白的免疫学研究奠定了基础。 相似文献
2.
吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定 总被引：5，自引：1，他引：4
将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫. 相似文献
3.
奶牛新孢子虫病PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的新孢子虫（N.caninum）Nc-5基因序列设计合成了1对特异性引物,建立了检测新孢子虫PCR方法。从新孢子虫ELISA检测抗体阳性奶牛血液中提取DNA,用PCR方法对新孢子虫基因组DNA进行扩增,并对扩增产物进行克隆及序列测定,证明其可靠性。结果显示,扩增的目的片段大小为350bp,扩增产物经MspⅠ酶切为218bp和132bp2条片段,与预期结果一致;序列分析表明,本试验扩增的Nc-5基因片段与GenBank发表的其他新孢子虫Nc-5基因序列同源性为99.6%～95.4%;通过敏感性、特异性、重复性试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速、准确、可靠的优点。 相似文献
4.
为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断. 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2020,(7)
为了查明科布多省牛只是否感染犬新孢子虫(Neospora caninum)并造成流产隐患,本文应用PCR方法,以新孢子虫NC-5为诊断靶基因,对随机采集科布多省3个检测点的120份牛血样进行DNA提取、扩增诊断,并基因测序。结果显示,成功获得了231 bp目的片段;测序结果经BLAST比对,与犬新孢子虫新西兰株(GenBank登录号:AY459289.1)同源性达99%,构建的系统发育树中,本株与犬新孢子虫聚为一支,置信度达99%。说明科布多省牛只已感染了新孢子虫;在3个检测点中,艾尔登特苏木乡感染率最高,为12.7%(7/55),总感染率为7.5%(9/120)。本文初次报道蒙古国科布多省牛群不同程度的感染新孢子虫,应该引起重视。 相似文献
6.
《动物医学进展》2016,(4)
根据新孢子虫Nc2基因保守区设计特异性引物,应用均匀设计法优化反应中Taq DNA聚合酶、引物浓度和退火温度等,建立新孢子虫二温式PCR检测方法。结果显示,扩增条带与预期目的片段大小(266bp)相符,未扩增出弓形虫等虫种的阳性DNA片段;扩增片段经克隆、测序发现与引物基因序列的同源性为100%;最低检出量为32.5fg/μL,是三步法PCR的10-1倍,但循环时间缩短了38min;重复3次对10-4、10-5、10-6和10-7稀释的阳性质粒进行二温扩增,10-7稀释均未出现扩增条带。同时对156份牛全血DNA进行检测,检出率为10.90%(17/156),与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499—2013)的检出符合率为83.33%(30/36),二者检测结果差异性不显著(P0.05)。由此可见,建立的二温式PCR检测方法可用于临床诊断和日常监测新孢子虫,为监控"带虫宿主"提供技术支撑。 相似文献
7.
本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。 相似文献
8.
牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。 相似文献
9.
从河南两个地区猪的粪便中分离纯化了猪源隐孢子虫卵囊。参考隐孢子虫Hsp70基因属特异性引物,用PCR分别扩增了卵囊基因组DNA大小均为1 948 bp的片段,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化,纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列和推测出的氨基酸序列分别用ClustalX软件与已报道的相应序列比对,用DNASTAR中的MegAlign分析其同源性,并用PAUP绘制系统发育进化树。序列分析结果显示河南猪源隐孢子虫两个分离株Hsp70 DNA序列的同源性为99.9%,与其他隐孢子虫相应序列同源性介于81.9%~99.8%之间,其中与猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis,AF221533)同源性最高分别为99.8%,97.9%;与安氏隐孢子虫(C.andersoni,AY954592)同源性最低。两个分离株推导Hsp70氨基酸序列的同源性为100%,同其他隐孢子虫相关序列的同源性在92.8%~99.8%之间。本研究为隐孢子虫诊断及流行病学研究打下了良好基础。 相似文献
10.
牛新孢子虫病PCR检测方法的建立和应用 总被引：1，自引：0，他引：1
犬新孢子虫感染是导致妊娠母牛流产的主要原因之一，准确快速地诊断是有目的治疗该病的前提。本研究根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列，设计了一对特异性引物，建立了检测犬新孢子虫的PCR技术。利用本方法可以从感染牛胎儿的脑脊液及实质脏器中扩增出1条大小为350bp的特异性核酸片段。在吉林省延边龙井地区的应用检测结果表明，流产牛胎儿中新孢子虫感染率为17％（15／90）。本方法在实际应用中快速、灵敏、特异性高，可以用于牛和其它动物新孢子虫病的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
11.
为了解牛新孢子虫NcSRS2基因的生物学特性,试验扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,亚克隆至pMD18-T载体后进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析,最后克隆至pVAXⅠ真核表达载体中,并进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果表明:牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列同源性为99%;构建的真核重组质粒pVAXⅠ-NcSRS2正确。 相似文献
12.
根据GenBank已发表的弓形虫529-bp重复序列(AF146527)设计巢式PCR引物,建立巢式PCR检测方法.结果表明,该方法能扩增出427 bp的片段,敏感性试验表明该方法可以检测出0.1 pg的弓形虫基因组DNA,敏感性是常规PCR的100倍.巢式PCR方法对蜥蜴利什曼原虫、隐孢子虫、细粒棘球绦虫基因组扩增无条带,特异性强.样品检测符合率达100％.巢式PCR方法的建立为弓形虫病的诊断及流行病学调查提供技术支持. 相似文献
13.
根据GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列设计合成2对巢式PCR引物,建立牛卵形巴贝斯虫巢式PCR诊断方法,对该方法的最佳反应条件进行了筛选,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR方法外引物扩增牛卵形巴贝斯虫基因组片段的长度为1 008bp,内引物为537bp;该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、弓形虫、犬新孢子虫基因组DNA;最低检测DNA含量为16fg;通过对46份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR阳性检出率高8.7%。本试验为牛卵形巴贝斯虫病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。 相似文献
14.
目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列,找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段,设计套式PCR两对引物,以UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板,初步建立了检测两种虫体的Nested PCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中,经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested-PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增,长度分别在800~900 bp、400~500 bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高,弓形虫和新孢子虫分别达99.1%、97.2%,但它们两者之间差异较大,同源性仅为86.6%。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点,挑选内切酶进行RFLP实验,结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vsp1酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验,实验证明该Nested PCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增,而对其它原虫基因未能扩增出任何片段;该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子/g猪肉。结论本实验建立Nested PCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫,而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。 相似文献
15.
为了研究牛结核病的PCR诊断方法,本研究以牛分枝杆茵(M.bovis)Vallee111株染色体DNA为模板,以RecA和Ppsl基因特异性引物进行PCR扩增,获得约860 bp和430 bp的DNA片段.将PCR纯化产物进行测序,通过BLAST序列分析,与GenBank中登录的M.bovis AF2122/97 RecA基因和Ppsl基因的核苷酸序列同源性均达到99%.在同一PCR反应中同时加入RecA和Ppsl基因特异性引物建立RecA-Pps1二联PCR反应.同时,RecA和Ppsl PCR扩增的敏感性分别达到585 fg和195 fg,特异性均达到100%,为进一步研究RecA和Ppsl基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础. 相似文献
16.
本试验筛选了新孢子虫病PCR检测的引物,运用《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)对根据犬新孢子虫Nc2和Nc5基因设计的PCR引物进行了评价。此外,同时运用F1/R1、F2/R2和SN/T 3499 F/SN/T 3499 R共同对14份荷斯坦牛和19份西门塔尔牛全血DNA进行PCR检测,旨在筛选出特异性较好的引物,建立新孢子虫病PCR检测方法和了解当地不同品系牛患新孢子虫病的感染率。结果显示,3对引物分别扩增出105、128和231 bp目的片段,均与预期目的片段大小相符;其中,F1/R1与SN/T 3499 F/SN/T 3499 R的最低检测量相同,为19.9 fg/μL,F2/R2最低检测量为199 fg/μL,说明F1/R1和SN/T 3499 F/SN/T 3499 R引物的敏感性更好;运用F1/R1、F2/R2引物分别对19.9 pg/μL和199 fg/μL模板重复进行4次扩增,均出现了较明亮的扩增条带,证明两对引物重复性较好。33份血液样品共检出6份阳性DNA,阳性率分别为21.43%和15.79%,检出复合率为100%。以上结果说明F1/R1和F2/R2引物均可作为新孢子虫病PCR的诊断引物,本试验初步建立了新孢子虫PCR方法,同时初步了解了当地牛群中新孢子虫感染情况,为有效预防和控制新孢子虫病提供了科学的理论依据。 相似文献
17.
《新疆畜牧业》2021,(2)
犬新孢子虫是牛流产的重要原因之一。为查清尼勒克县规模化养殖的牛群出现流产的原因,本文应用PCR检测方法,以新孢子虫NC5为诊断靶基因,对采自流产多发地—某乡8个养殖户的共计260份牛全血DNA进行诊断,并测序。结果显示,成功获得了231bp目的片段,新孢子虫病总感染率为5.0%;构建的系统发育树中,本株与Genbank上传的瑞士株(登录号:X84238)、英国株(登录号:DQ07766)亲缘关系较近,置信度达97%,说明新孢子虫病是导致牛群发生流产的主要原因之一。本次调查结果不仅为该地区的养牛业新孢子虫病的防控提供了基础数据,而且有利于当地兽医工作者建立一套符合当地实际情况的综合防制体系。 相似文献
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猪附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中已登录的猪附红细胞体新的基因组DNA序列设计引物,从疑似猪附红细胞体(Mycoplasma suis)感染猪全血样品基因组DNA中扩增出了预期长度666 bp的目的DNA片段,通过对24份临床疑似病例样品的PCR扩增及其他病原微生物基因组DNA的特异性扩增试验,建立了E.suis的PCR诊断方法;进一步对PCR产物克隆、测序分析表明,与国外已报道的AJ504999株相关区域核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.19%和96.85%,表明我国分离株与国外株基因组存在差异。 相似文献
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为了解犬新孢子虫Nc-GFP株的生物学特性,本试验采用Vero细胞培养的犬新孢子虫速殖子,腹腔接种BALB/c小鼠,观察小鼠的临床症状及发病情况,脱颈处死濒死期小鼠,无菌分离小鼠脑组织,接种Vero细胞进行连续培养,并提取脑组织DNA进行NcMAG1基因的PCR鉴定。结果显示:BALB/c小鼠接种犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子后,先后出现被毛逆立、共济失调等临床症状;小鼠脑组织接种Vero细胞14 d后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光的犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子和包囊;小鼠脑组织经NcMAG1基因的PCR检测,扩增出1 047 bp的目的基因条带,经测序与GenBank中发表的NcMAG1(EF580924.1)核苷酸序列的同源性为99.6%。本试验成功地从BALB/c小鼠脑组织中分离出了犬新孢子虫Nc-GFP株,为Nc-GFP株生物学特性的深入研究奠定了基础。 相似文献
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表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献