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乙型脑炎病毒SAl4—14—2株prM基因的克隆与测序 总被引：1，自引：1，他引：0
以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prM基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prM基因,扩增出大小约558bp特异性带。将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明我国疫苗株SA14-14-2的prM基因核苷酸序列与GenBank收录的完全一致。prM基因的获得为进一步研究该基因的免疫原性以及乙型脑炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定 总被引：4，自引：1，他引：3
收集一例疑为乙型脑炎病毒感染的种公猪肿大的睾丸病料,并将其处理制成匀浆过滤后,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离病毒,然后设计一对PrM/E基因的特异性引物,采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定,并将其PrM/E基因扩增产物测序,测序结果与乙型脑炎GenBank登陆的SA14-14-2株(AF315119)和SA14株(U14163)进行比较。结果表明,所分离病毒的PrM/E基因序列与JEV强毒株SA14和弱毒株SA14-14-2相应序列同源性分别为98.1%和97.1%,证实分离毒株为乙型脑炎病毒。 相似文献
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乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。 相似文献
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该研究通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM/E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEV SA14基因序列和SA14-14-2进行比较分析,结果发现分离株与JEV SA14强毒株的同源性为98.1%,与SA1-14-2株的同源性为97.1%;在477-2477长为2 000 nt决定JEV抗源性的PrM/E区中.分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列(E135和E232)与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14-14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14-14-2不同.由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株.由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义. 相似文献
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猪乙型脑炎病毒E基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因,将扩增的目的片段进行克隆与序列分析。结果表明,所克隆的E基因编码结构域（Domain）区段与SA14-14-2、P3、Beijing-1等毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别达97.2%与96.8%以上,属于Ⅲ型乙型脑炎病毒,与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有8个氨基酸位点变异。 相似文献
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《养殖与饲料．饲料世界》2016,(9)
乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的急性、自然疫源性蚊媒传播人兽共患传染病。猪是JEV最重要的宿主,监测和预防猪乙脑的发生对于人乙脑的防控具有重要意义。本研究通过RT-PCR、细胞接种、乳鼠脑内接种、电镜观察等方法,从广西某猪场的猪脑组织样品中分离了1株乙型脑炎病毒,命名为GX1209。全基因组测序结果表明,该毒株基因组为10 965 bp。系统进化分析表明该毒株属基因Ⅰ型,与基因Ⅰ型XJ69毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,达到99%,而与SA14、SA14-14-2、P3等Ⅲ型毒株的氨基酸同源性分别为98%、97%、98%。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(3)
为了解上海地区猪场蚊媒携带乙型脑炎病毒(JEV)的流行情况,本研究对2014年上海地区猪场采集的4 000只蚊媒样品进行了病毒分离、RT-PCR及间接免疫荧光鉴定。结果表明,分别从三带喙库蚊和中华按蚊中分离到两株JEV,命名为MH-7株和PD-19株。E基因序列分析显示MH-7株属于基因Ⅰ型,PD-19株属于基因Ⅲ型。与减毒活疫苗株SA-14-14-2株E基因核苷酸和编码氨基酸比较结果显示,MH-7株的同源性分别为87.4%和97.2%;PD-19株为98.1%和97.2%。将两株分离株分别接种3日龄乳鼠,均可在72 h之内致乳鼠死亡,表明它们均具有较强的神经毒力。本研究为上海当地制定JEV防制方案提供了实验依据。 相似文献
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猪日本脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
设计了1对引物,利用RT-PCR技术检测乙型脑炎病毒(JEV)。从GenBank中查出收录的31株猪乙型脑炎病毒E基因的已知序列,用DNA star软件对这31株猪乙型脑炎病毒E基因进行同源性分析,以确定扩增的靶序列。以这段靶区域为模板,利用Primer 5软件设计了1对引物,用减毒株SA14-14-2建立了检测乙脑病毒的RT-PCR方法,经敏感性,特异性试验测定,证明该方法敏感,特异;该法可检出样品稀释至256倍的鼠脑毒,相当于0.06个TCID50,对4株河北地区JEV分离株进行检测,结果所设计引物对4株病毒均能扩增出预期的片段。 相似文献
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本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：5，自引：2，他引：3
收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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该研究通过RT—PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM／E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEVSA14基因序列和SA14—14—2进行比较分析,结果发现分离株与JEVSA14强毒株的同源性为98．1％,与SA1-14-2株的同源性为97．1％;在477-2477长为2000nt决定JEV抗源性的PrM／E区中,分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列（E135和E232）与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14—14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14—14—2不同。由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株。由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义。 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(6):915-922
2012年从四川省多个地区的猪场采集流产死胎10份,采用BHK-21细胞培养方法分离出3株乙型脑炎病毒,分别命名为JEV-SC-1、JEV-SC-2与JEV-SC-3株,E基因与现用疫苗株SA-14-14-2的核苷酸相似性分别为99.24%、99.05%及98.76%,基因分型研究显示3株病毒株均为基因Ⅲ型,分离株在BHK-21细胞中均能产生明显的细胞病变,其TCID50分别为10-5.81/0.025、10-5.12/0.025及10-4.42/0.025mL。以JEV-SC-1株分别感染BHK-21细胞和Vero细胞,观察病变情况并利用荧光定量PCR法绘制其在这2种细胞中的生长曲线,检测该毒株在BHK-21细胞上连续传代后不同代次的病毒含量。结果显示,JEV-SC-1株在这2种细胞中均能增殖,但CPE及病毒滴度有所差异:JEV-SC-1株感染Vero细胞的病毒滴度较BHK-21细胞高,但出现细胞病变时间较晚;JEV-SC-1株在BHK-21细胞上连续传代至20代,第1代至第10代病毒含量呈上升趋势,10代以后病毒含量趋于稳定,波动幅度较小。本试验为大规模生产疫苗提供理论支持,同时也为进一步研究JEV-SC-1株的生物特性奠定了基础。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(2)
云南省文山市某规模化猪场2015年7~8月频繁发生以种公猪一侧睾丸肿大,母猪流产、产死胎、木乃伊胎及弱仔为主要临床症状的繁殖障碍疫情。为了查明病因,对送检流产胎猪进行病理解剖,采集胎猪及胎盘病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型及美洲型毒株、猪细小病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、猪流产衣原体、布氏杆菌及弓形虫PCR和realtime PCR检测,同时应用猪肾原代细胞及BHK-21传代细胞进行病毒分离鉴定以及细菌分离鉴定。检测结果显示,从流产胎猪内脏器官、大脑及胎盘组织扩增出乙型脑炎病毒pr M基因及伪狂犬病毒g E基因目的条带。序列分析结果显示,扩增的乙型脑炎病毒pr M基因序列与NCBI Gen Bank中的参考毒株(Accession no.AB594829.1)序列同源性达99%;伪狂犬病毒g E基因核苷酸序列与NCBI Gen Bank中的参考毒株(Accession no.KT936475.1)序列同源性达100%。应用BHK-21传代细胞盲传分离获得1株可致细胞病变(cytopathic effect,CPE)的病毒株,鉴定为乙型脑炎病毒,并命名为JEV-2015-WS-YN。由此推测,引起此次猪群繁殖障碍极有可能为日本乙型脑炎病毒和伪狂犬病毒共同感染造成。 相似文献
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本试验通过鸡胚矮小试验、血凝试验和RT-PCR等方法,从华北地区某鸡场发生疑似肾型传染性支气管炎的发病鸡群分离了1株鸡传染性支气管炎病毒,命名为SX01株.结果显示该分离株能引起鸡胚典型的临床症状;经1%胰酶处理后的尿囊液可凝集鸡红细胞,而未处理的则无血凝活性;利用RT-PCR对分离株M基因序列测定分析结果显示,SX01株的M基因核苷酸序列与GX-GL分离株同源性高达99.4%,与QX基因型毒株SDZB0808核苷酸同源性高达99.1%,与H120株同源性仅为90.0%,与BJ/00/02株M基因核苷酸同源性较低,为90.6%.遗传进化分析结果显示,该分离株与中国地方型分离株(GX-GL、SDZB0808、CK/CH/LJL/110302、DY07、IBVSX7)亲缘关系较近,位于同一进化分支;与H120代表的Mass型疫苗株的亲缘关系较远,是一株肾型传染性支气管炎病毒毒株. 相似文献
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乙型脑炎病毒结构蛋白基因的克隆表达与免疫特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
研究分别克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株的结构蛋白C、PrM/M及E蛋白基因.将3个结构蛋白基因分别插入表达质粒pET30(a)中,成功构建3个原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPGT诱导,SDS-PAGE分析结果表明,3个结构蛋白获得了表达,表达产物大小与预期一致.Western-blot分析结果表明:表达产物中PrM/M和E蛋白具有很好的免疫反应性,可被抗乙型脑炎病毒血清很好地识别;而C蛋白的免疫反应性较差,不能很好地被乙型脑炎病毒阳性血清识别.该结果提示,乙型脑炎病毒结构蛋白中除E蛋白外PrM/M蛋白也很可能具有诊断抗原的应用潜能. 相似文献