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为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。 相似文献
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本试验旨在实现猪β防御素1 (poricine-β-defensin 1,PBD-1)在毕赤酵母中的表达,获得有抗菌活性的抗菌肽PBD-1。根据PBD-1的氨基酸序列和酵母密码子偏好性,设计优化其核苷酸序列,利用SOE-PCR技术获得PBD-1基因序列,克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-PBD-1,经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母SMD1168中。PCR筛选得到阳性酵母表达菌株,经甲醇诱导后得到分子质量约4.5 ku的抗菌肽PBD-1。抗菌特性研究结果表明,表达产物抗菌肽PBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果。 相似文献
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根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,在不改变其编码的氨基酸序列的前提下,对鸡IFN-α序列进行PCR介导的定点突变优化,将鸡IFN-α成熟肽序列中136～143位相近的4个Arg密码子和N端的6个稀有密码子突变为毕赤酵母高表达优越密码子,构建了含正确突变和未突变序列的克隆载体pMD-IFNm、pMD-IFN和酵母表达载体pPICZ-IFNm、pPICZ-IFN,电击转化毕赤酵母X-33菌株,经筛选、鉴定表明鸡IFN-α基因已整合到酵母基因组中.通过表达产物的抗病毒活性测定,筛选出突变与未突变高表达酵母转化子各1株.经密码子优化的突变重组酵母菌株PP-IFNm于BMMY培养基中诱导72 h上清中抗病毒活性单位可达410U/mL,其活性比未优化重组酵母株PP-IFN(48.33U/mL)提高了约10倍. 相似文献
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绵羊生殖道抗菌肽cDNA克隆及真核表达载体构建 总被引：2，自引：2，他引：0
绵羊生殖道抗菌肽（ORTAP40）是从中国美利奴绵羊生殖道分离的一种新型的阳离子抗菌肽,在绵羊发育早期的防御中起到了主要的作用。在本研究中,根据ORTAP40 N端氨基酸序列设计引物,利用3′RACE技术克隆了绵羊生殖道抗菌肽3′末端全长cDNA序列,并被GenBank收录,登录号为FJ514476,经过cDNA序列分析显示,ORTAP40是一个4.8 ku的小肽,与先期分离纯化的分子质量一致。作者随后参照巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性,设计并人工合成了ORTAP40成熟肽目的基因片段,所合成的ORTAP40基因全长120 bp,通过基因重组的方法将目的基因克隆到pPIC3.5K和pPICZαA表达载体上,成功构建了重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-ORTAP40和外泌表达载体pPICZαA-ORTAP40,为抗菌肽的开发和应用奠定了基础。 相似文献
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前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。 相似文献
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抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。 相似文献
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为获得高效表达的重组猪β干扰素,在保留编码蛋白序列的同时,对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA.构建了酵母表达裁体pPICZαC-PIB.pPICZαC-PIB经Sac Ⅰ酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33.对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得1株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约258.3 mg/L,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍.经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达产物为相时分子质量约22 000和24 000的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应.将表达产物进行氨基酸测序,测得2段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致.在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍.用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明.猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性. 相似文献
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为了构建高效低毒的新型抗菌肽,将抗菌肽Eumenitin及其序列修饰后获得4条新型短肽的毕赤酵母真核表达载体,采用生物信息学方法对Eumenitin及其衍生肽的理化参数进行预测,基因序列经毕赤酵母密码子优化后,克隆至pMD19T-simple载体上,鉴定后连接至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,构建的重组表达质粒经Avr Ⅱ线性化后,电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布于YPDSZ平板上,进行表型筛选和高拷子筛选,并对5条短肽的溶血率进行测定。结果显示:Eumenitin及其衍生肽均为较稳定的疏水性多肽,空间结构以α螺旋为主,且序列中不含有信号肽。经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,成功构建了5条短肽的毕赤酵母重组表达载体,经设计改造后的抗菌肽溶血性均较低。本研究结果为后续进行重组蛋白的表达以及抑菌活性研究奠定了基础,以期获得抗菌活性强、溶血性低、高表达的新型抗菌肽。 相似文献
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为了构建一种胞内表达人溶菌酶(hLZ)的毕赤酵母工程菌,此研究以人工合成人溶菌酶基因序列,通过酶切位点插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,获得pPICZαA-hLZ。线性化该表达载体,电转化并筛选阳性克隆,甲醇诱导重组蛋白表达后,进行纯化和活性分析。结果表明,通过亲和层析树脂(Ni-IDA)从培养液上清纯化目标蛋白,SDS-PAGE表明目标蛋白为14.7 kDa左右,Western-blot结果表明目标蛋白即为带有6个His标签的重组人溶菌酶,BCA法测定表明纯化后的蛋白浓度为0.121 mg/mL;溶壁微球菌抑菌试验表明该重组人溶菌酶具有部分生物活性。此研究成功地获得了胞内表达且具有部分生物活性的人溶菌酶毕赤酵母工程菌,为重组人溶菌酶作为饲料添加剂开发应用奠定了一定的基础。 相似文献
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林蛙嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆、分析及蛋白结构预测 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank上发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用PCR方法,扩增出与预期设计的740 bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为740 bp,共编码246个氨基酸.该基因片段与已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列同源性为98.78%,氨基酸同源性为98.78%.利用生物信息学和分子生物学软件,对嗜水气单胞菌外膜蛋白的结构进行预测,结果表明其为外膜孔蛋白.本试验为嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(19)
为使鸡源志贺氏菌IpaC蛋白保持天然的生物学活性,在毕赤酵母表达系统中实现分泌表达,进一步研究IpaC蛋白的生物学功能,本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下,根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因,利用真核表达载体p GAPZA和8种真核信号肽,分别构建真核表达载体pGAPZA-Inu/Inv/Kil/Lys/Mat/Amy/Glu/Ser-IpaC#,然后将线性化的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子进行表达,并用SDS-PAGE及Western-blot检测其表达产物。结果表明:在8种重组菌表达产物的菌体沉淀中检测到大小约为60 ku的目的蛋白。说明鸡源志贺氏菌IpaC基因成功实现了在毕赤酵母的胞内表达。 相似文献
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构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。 相似文献
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致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达 总被引：4，自引：0，他引：4
根据 Gen Bank中致病性嗜水气单胞菌气溶素 (Aer)基因的序列设计引物 ,以国内嗜水气单胞菌分离株为模板 ,扩增出 Aer基因的全长序列。经 T载体克隆和序列测定 ,证实克隆了国内分离株的不含信号肽的 Aer全长基因。将该基因以正确的读码框架与表达载体 p ET2 8b连接 ,经 IPTG诱导、SDS- PAGE检测 ,外源基因获得高效表达。诱导 4 h的培养物中 ,融合蛋白的表达占菌体总蛋白含量的 4 8.5 7%。 Western-印迹结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌产生的天然毒素 ,而且天然毒素制备的抗体也能识别纯化的重组毒素 相似文献
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潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72 h表达上清LL37蛋白含量约为167 μg /mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06 μg/mL。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(11)
为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将蜂毒肽(Melittin)与贻贝素B(Mytilin-B)的核心功能序列杂合,以Melittin(3-14)和Mytilin-B(13-27)的成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,采用SOE方法合成杂合抗菌肽Mel-MytB(MEM)基因。改造后的基因克隆到pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-MEM,而后经SacⅠ酶切线性化后电转入毕赤酵母受体菌X-33。结果表明,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子质量约3.0ku的Mel-MytB杂合抗菌肽获得表达,具有热稳定性和酸稳定性,煮沸40min、pH 2.0～10.0范围内抑菌活性基本不变。抗菌特性研究结果表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,其对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923/ATCC6538、肠道沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、副溶血弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562、枯草芽孢杆菌ATCC6633的MIC值分别为5.1、2.2、2.0、4.6、7.6、9.4、13.2和59.4μg/mL。因此,重组抗菌肽Mel-MytB在疾病防治和动物饲料添加剂等方面具备较好的应用前景。 相似文献