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1.
为通过复制不同牛支原体(Mycoplasma bovis)感染模型,筛选出毒力较强的M.bovis分离株,本研究采用等浓度的6株M.bovis分离株(W70、1738、677、Q1、Q3、JX02)感染7日龄健康鸡胚和6周龄～8周龄SPF级BALB/c小鼠,观察并比较各组受试动物死亡情况及病理剖检变化,取死亡鸡胚尿囊液或卵黄液,以及小鼠肺组织进行病原学分离培养和PCR鉴定.实验结果表明:各感染组BALB/c小鼠虽然出现一定程度的体重增长抑制,但小鼠并无任何临床呼吸道症状和病理剖检变化,并且病原学分离培养及PCR鉴定结果也均为阴性.在鸡胚感染试验中,6株M.bovis分离株对鸡胚表现出较好的感染性和致死性.感染组鸡胚致死率与对照组比较差异极显著(p＜0.01),而6个分离株间鸡胚致死率也表现出显著差异(p＜0.01).其中,以W70株感染后鸡胚死亡率最高,达63.3％;677株感染后死亡率最低,仅为20％,鸡胚死亡情况大多发生在感染后一周内,而后期仅有零星死亡.综合上述实验结果,初步筛选出W70株、1738株、Q1株、Q3株为毒力相对较强的分离株;与此同时,BALB/c小鼠的建模还需进一步研究. 相似文献
2.
为鉴定牛支原体(M.bovis)菌体免疫相关蛋白及其免疫原性,本实验以M.bovis湖北株为样品,通过建立M.bovis全菌蛋白的双向电泳体系,获得了分辨率及重复性良好的双向电泳(2-DE)图谱。利用western blot技术进行筛选,鉴定得到多个M.bovis蛋白,其中一个分子量为68 ku,经过质谱分析和氨基酸一级结构比对确定该蛋白为硫锌酰胺脱氢酶(LipDH)。经原核重组表达,LipDH重组蛋白与M.bovis阳性血清的western blot反应为阴性,而Dot blot及以重组表达蛋白作为包被抗原的ELISA鉴定结果均为阳性。本研究为进一步研究LipDH的功能以及采用其重组蛋白用于该蛋白缺失的M.bovis疫苗株的鉴别检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
3.
为了解鹿源牛分枝杆菌(M.bovis)基因多态性,初步建立适合吉林省鹿源M.bovis的基因分型方法,本研究利用12个分枝杆菌散在重复单位(MIRU)位点,对96株鹿源M.bovis吉林分离株进行MIRU基因分型研究.结果显示,12个位点中有8个位点(MIRU2、4、16、23、27、31、39及40)具有多态性,可以将96株菌株分为1 1个基因型,分辨力指数(H)为0.893,其中6个中度多态性位点的分辨力为0.877.其余4个位点(MIRU 10、20、24及26)未显示多态性.研究结果表明,鹿源M.bovis与其他宿主来源的M.bovis在基因分型上存在差异.MIRU位点对鹿源M.bovis具有良好的分辨力,该分型方法可以作为鹿结核病分子流行病学研究的有效方法. 相似文献
4.
牛支原体新基因(P18)的克隆表达及活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
牛支原体(M.bovis)可以引起犊牛肺炎、关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎等疾病,是一种牛的重要呼吸道病原体,目前M.bovis粘附宿主细胞的机制还不明确。研究表明,M.bovis表面存在的多种蛋白与致病菌在宿主体内的侵袭力与传播能力有关。我们通过分离表达多个M.bovis基因,最终获得了一个表达纤溶酶原结合蛋白的新基因,并命名为P18。该基因表达大小约为67ku的重组蛋白。通过western blot鉴定,重组表达的P18蛋白可以被M.bovis抗体识别。进一步的试验表明,P18蛋白还具有纤溶酶原结合活性,从而推测该基因表达的蛋白可能是M.bovis的一个粘附相关因子。 相似文献
5.
用SDS—PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白 总被引：6，自引：1，他引：5
应用SDS－PAGE对鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)4个标准株和5个广西分离株的结构蛋白进行了比较分析。结果，在凝胶电泳图谱中10－100ku蛋白分子质量之间，F株缺少87ku蛋白带，Y3株在最靠近87ku蛋白带的上方和下方各缺少1条蛋白带，H2株和Y2株缺少64ku蛋白带，CH株缺少29ku蛋白带，97、75、43ku处的蛋白带为4个MG标准株和5个MG分离株所共有。表明9个MG供试菌株的结构蛋白都存在一定的差异，广西MG分离株的结构蛋白呈现多样性。 相似文献
6.
为构建表达牛分枝杆菌(M.bovis)PE_PGRS62蛋白的重组耻垢分枝杆菌,本研究以M.bovis基因组DNA为模板PCR扩增PE_PGRS62基因,获得大小约为1 515 bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,将重组pMV-PE_PGRS62穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,42℃热诱导重组耻垢分枝杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的PE_PGRS62蛋白分子量约为60 ku,免疫印迹结果表明,表达的PE_PGRS62蛋白与兔抗M.bovis阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究M.bovis致病机理奠定了基础。 相似文献
7.
传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。 相似文献
8.
为分析商品化嗜水气单胞菌(Ah)败血症灭活疫苗生产菌株J-1与近年来分离的YYK090901菌株的抗原性是否存在差异,本研究应用western blot检测了抗J-1血清和抗YYK090901血清识别28株嗜水气单胞菌全菌蛋白情况,并通过细菌凝集试验测定了这2种抗血清与28株菌株的凝集效价。结果表明2种抗血清均能够识别25株菌株的大多数全菌蛋白,但识别GYK1、G060718-2L、Ah120606L 3株菌株的蛋白条带较少,2种抗血清识别同一株菌的全菌蛋白条带不完全一致。抗YYK090901血清对YYK090901、Ah120606L、JX120701具有较高的凝集价(211),对J-1、GYK1等16株菌的凝集价为26~210,其中对J-1、GYK1的凝集价分别为27、210;对N-1-2、TTF20130613L等9株菌的凝集价较低,为24~25。抗J-1血清对1990s年和2012年~2013年分离的大部分菌株均具有较高的凝集价(211~212),仅对GYK1、TTF20130613L等6菌株凝集价较低,为24~25。本研究结果表明,J-1与YYK090901的抗原性存在一定的差异。 相似文献
9.
副猪嗜血杆菌外膜蛋白的免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
对来自江西、广东、上海三省市的82个副猪嗜血杆菌野外分离株进行SDS-PAGE分析,采用强毒力野外分离株的多克隆抗血清,通过Western blotting对副猪嗜血杆菌OMP和全细胞蛋白的免疫原性进行研究,寻找具有共同抗原决定簇的免疫原性蛋白.结果表明免疫血清对不同来源的分离株具有良好的交叉免疫反应,患病猪的分离株OMP和全细胞蛋白具有较强的免疫原性,健康猪的分离株OMP免疫原性较全细胞蛋白免疫原性弱.不同菌株的共同免疫原性蛋白为OMP中相对分子质量为37 000～40 000、28 000～30 000的蛋白. 相似文献
10.
试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。 相似文献
11.
Characterisation of the outer membrane protein antigens of British field isolates of Moraxella bovis 总被引：1，自引：0，他引：1
Outer membranes of a single isolate of Moraxella bovis were prepared and their purity evaluated by a comparison of the iodinated proteins from whole cells and on outer membranes. The protein patterns of the outer membranes of 10 isolates were examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the antigenic relationship between proteins of different isolates determined by immunoblotting, using antiserum produced against the outer membrane of the single isolate of M. bovis. The overall protein pattern of the different isolates was similar although not identical, but, significantly, only three separate immunogenic proteins were common to all the isolates under examination. 相似文献
12.
试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D450 nm值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。 相似文献
13.
Outer membranes were isolated from bovine isolates and type strains of Moraxella bovis, M phenylpyruvica, M lacunata, and M ovis by sodium N lauroyl sarcosinate extraction and differential centrifugation. Analysis of outer membranes from these organisms by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-gel electrophoresis revealed that all M bovis isolates shared a common polypeptide pattern that was readily distinguishable from other Moraxella spp. Nine major outer membrane protein bands were identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-gel electrophoresis analysis of M bovis. Immunoblotting of protein antigens of M bovis revealed several outer membrane proteins that seemed to be common antigens of all M bovis isolates. 相似文献
14.
This study was aimed to construct a shuttle expression vector of Mycobacterium bovis(M.bovis) eis gene and identify its bioactivity in recombinant Mycobacterium smegmatis (M.smegmatis). M.bovis eis gene was cloned by PCR and the shuttle expression vector pMV261-Mbeis was constructed, then it was identified by double digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transformed into M.smegmatis mc2155 by electroporation. The expression of M.bovis eis gene in M.smegmatis was detected by SDS-PAGE and Western blotting, and the amino acids sequence of the target protein was identified by mass spectrometry. The growth curve of recombinant M.smegmatis mc2155 containing pMV261-Mbeis was successfully constructed.The results showed that pMV261-Mbeis did not affect the growth of M. smegmatis in vitro. The results of SDS-PAGE and Western blotting confirmed that the M. bovis eis gene expressed the eis protein which was about 44 ku in M. smegmatis. Mass spectrometry proved that the protein was the eis protein of M. bovis.The expression vector pMV261-Mbeis was successfully constructed and the expressed recombinant protein was proved to be have biological activities in M. smegmatis, which laid a foundation for the further study of the function of eis protein in M. bovis. 相似文献
15.
试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44 ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
16.
以临床疑似犬瘟热病犬外周血总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒(CDV)血凝素(H)基因。序列测定和分析表明该病料犬瘟热病毒H基因序列与国内其他地区分离到的毒株同源性较高(94.6%~99.2%),而与Onderstepoort株、Convac株等疫苗毒株的同源性较低(90.4%~91.2%)。分子遗传进化分析显示所有毒株可分为7个大的分支,且各分支间具有一定的地域性,其中待检病料中CDV与大多数中国分离株一样处于Ⅰ型。进一步以H全基因为模板,截短表达其3′端816 bp、459 bp两个片段,并克隆入原核表达载体pET30 a进行表达。结果显示它们分别能表达大小约为36.4 ku和22.2 ku的融合蛋白。免疫转印表明该纯化蛋白均可与犬瘟热病毒抗血清发生阳性反应,说明重组蛋白具备抗原性,可用于进一步的血清学研究。 相似文献
17.
The cytotoxicity of Moraxella bovis whole cells and culture filtrates was studied, using 51Cr-labeled bovine and human blood neutrophils. The cytotoxicity of living M bovis was directly related to the concentration of bacteria in the neutrophil cultures, and was maximal at an approximate neutrophil to bacteria ratio of 1:10. Cytotoxicity was maximal by 30 minutes after living bacteria were added to the suspension of the 51Cr-labeled neutrophils. Expression of the cytotoxicity was dependent on the presence of Ca2+ in the media, and was independent of the presence of Mg2+. Cytotoxic activity was eliminated by inactivating M bovis in buffers containing formalin or sodium azide. Hemolytic and nonhemolytic isolates of M bovis were examined for cytotoxic activity. All 7 of the hemolytic isolates were cytotoxic for bovine neutrophils, but all 4 of the nonhemolytic isolates were devoid of cytotoxic activity. None of the 11 isolates were cytotoxic for human neutrophils. Sterile filtrates from 6-hour shaker cultures of a hemolytic M bovis isolate were cytotoxic for bovine neutrophils. Cytotoxicity of the filtrate was eliminated by heating, incubation with trypsin, or addition of EDTA to the media. Bacterial homogenates or sterile filtrates prepared from statistically incubated cultures of M bovis were not toxic for bovine neutrophils. 相似文献
18.
猪链球菌血清2型JX02株溶血素基因的克隆及序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
采用特异性引物对猪链球菌2型(Streptococus suis type 2)JX02菌株进行PCR扩增，将扩增到的溶血素基因克隆到pMDl8-T质粒栽体中，经鉴定后测序。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，与P1／7株和US-1933株等进行序列比较，核苷酸同源性为100％和99．7％，氨基酸序列同源性为100％和99．8％。 相似文献
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牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。 相似文献