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1.
为确定猪嗜血支原体(M.suis)在临床的感染情况和进行流行病学调查提供检测方法,本研究以纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和辣根过氧化酶标记的MSG1蛋白单抗建立了检测猪嗜血支原体的阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.5μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶1,作用时间为37℃1.5h,酶标单抗最佳稀释度为1∶10 000,作用时间为37℃1h.通过对100份M.suis阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥23.71％时判为阳性,PI≤36.35％时判为阴性,23.71％＜PI＜ 36.36％时判为可疑.敏感性、特异性和重复性试验证明该检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好,可用于M.suis流行病学调查和疾病诊断. 相似文献
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猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。 相似文献
3.
利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。 相似文献
4.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。 相似文献
5.
猪戊型肝炎病毒抗体间接ELISA诊断方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验建立了应用高效融合表达的重组抗原PET32a-p214检测猪戊型肝炎病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法。确定了抗原最适包被浓度为6μg/mL;血清最适稀释度为1∶100,作用时间为60 min;酶标抗体最适稀释度为1∶4 000,作用时间为60 min;判定标准为OD值≥0.339为阳性,OD值<0.339为阴性。实验结果表明该法特异性、敏感性和重复性均较好,与万泰公司戊型肝炎病毒抗体诊断试剂盒检测猪血清的符合率为98.6%。该方法的建立为猪戊型肝炎病毒抗体检测和进行猪戊型肝炎流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。 相似文献
6.
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D450 nm≥ 0.289判为阳性,D450 nm≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。 相似文献
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本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。 相似文献
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猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用 总被引：1，自引：1，他引：0
以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型（PCV-2）重组结构蛋白（rCap蛋白）为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm＜0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm＞0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm＜0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。 相似文献
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以纯化的大肠埃希菌K88菌毛蛋白为包被抗原,建立了检测大肠埃希菌K88IgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件,即最佳抗原包被浓度为1μg/mL,兔抗体稀释倍数为1∶10,猪抗体稀释倍数为1∶100,确定最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5h,血清反应时间0.5h,二抗反应时间1h,底物室温反应时间为15min,阴阳性临界值兔血清为0.33、猪血清为0.45。证实该间接PPA-ELISA方法特异性强、重复性好、敏感度高,可以作为疫苗效力检验和流行病学调查的参考方法。 相似文献
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猪巨细胞病毒(PCMV)是引起新生仔猪死亡、鼻炎、肺炎和生长速度减缓的重要病原之一,我国尚无有效的诊断方法.为建立检测PCMV的ELISA方法,本研究以重组PCMV囊膜糖蛋白B(gB蛋白)为包被抗原,优化反应条件:抗原包被量0.4 μg/mL,待检血清稀释度1∶100,37℃包被2h后4℃过夜,5％脱脂乳37℃封闭2h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用2h,抗体临界值为S/P≥0.354判为阳性,S/P≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑,建立了PCMV抗体间接ELISA检测方法.与猪瘟、猪伪狂犬病、猪附红细胞体病、副猪嗜血杆菌及猪圆环病毒2型等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76％,从而为PCMV检测和流行病学调查提供了有效方法. 相似文献
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利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37 ℃封闭2 h;血清最适稀释度为1∶100,37 ℃作用2 h;兔抗猪IgG/辣根酶（HRP）（1∶3000）,37 ℃作用2 h;37 ℃避光显色15 min读取D450 nm值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D450 nm值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D450 nm值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。 相似文献
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利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。 相似文献
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建立一种检测兔病毒性出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法。对RHDV陕西分离株VP60基因进行原核表达,Western blot分析表达产物的免疫反应性;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP60蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为42.34 ku的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被浓度2.9μg/mL,37℃2 h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2 h,待检血清37℃孵育1 h,酶标抗体1∶10 000稀释,37℃作用1 h,37℃显色5 min,临界值为0.340;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与血凝抑制试验的符合率为74.1%,与商品化试剂盒检测结果符合率为94.8%。该方法可用于临床样品的大批量检测。 相似文献
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猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。 相似文献
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【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D450 nm值≥0.365时,判定为阳性;当D450 nm值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。 相似文献
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WANG Li-zhen LUO Gui-fang ZHANG Yan-ping SHEN Yong WU Yuan-xiao SHI Yan CHEN Rui-ai HE Dong-sheng 《中国畜牧兽医》2017,44(2):377-383
Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D450 nm≥0.289,as negative when D450 nm≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future. 相似文献