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1.
氨肽酶N(pAPN)是一种常见的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的细胞受体。为研究抗pAPN的单链抗体(scFv),试验设计一系列简并引物,通过RT-PCR方法从免疫了天然pAPN的BALB/c小鼠脾中克隆了免疫球蛋白轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的编码基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)用12个氨基酸的连接肽将VL和VH的扩增产物随机连接,从而获得单链抗体基因。将整个单链抗体基因与T7Select10-3b载体连接,通过体外包装获得了针对pAPN的鼠源ScFv噬菌体文库。pAPN单链抗体初级文库包含2.0×107个重组噬菌体克隆,扩增后的文库滴度达到3.6×109 PFU/mL。Bst NⅠ酶切分析和DNA测序结果显示,28个pAPN抗体初级文库的噬菌体克隆多样性良好。以pAPN C亚基重组蛋白为包被抗原,用噬菌体ELISA进一步验证抗pAPN单链抗体库的活性。本研究主要介绍了采用T7噬菌体展示系统构建猪冠状病毒TGEV和PEDV通用受体pAPN的鼠源单链抗体库及其鉴定。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(6)
本研究旨在进行猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列(登录号:NM_214277)相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17～33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。 相似文献
3.
试验为了构建猪氨肽酶N（pAPN）不同基因片段大小的重组质粒并进行原核表达及纯化,经Western—blot、ELISA方法初步鉴定猪氨肽酶N受体功能区。试验构建重组了质粒pET30a—pAPN1（106～669nt）、pET30a—pAPN2（670-1044 nt）、pET30a—pAPN3（1045-1773nt）、pET30a—pAPN4（1774～2328 nt）、pET30a—pAPN5（2329—2889 nt）、pET30a—pAPN6（106—1044nt）、pET30a—pAPN7（1774—2889 nt）;转化宿主菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导表达蛋白,包涵体经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳回收纯化;用Western—blot、ELISA方法经抗pAPN多克隆抗体初步筛选出pAPN受体功能区。结果表明：pET30a—pAPN2、pET30a—pAPN3、pET30a—pAPN6、pET30a—pAPN7蛋白均以包涵体形式表达并纯化。pET30a—pAPN3、pET30a-6、pET30a-7能与抗pAPN多抗产生特异性反应。经抗pAPN多抗筛选初步鉴定出其主要抗原功能区在36—153aa、349—591aa、592～963aa内。 相似文献
4.
[目的]预测南阳牛BoLA-DRA编码蛋白区的理化性质和结构特征.[方法]运用生物信息学分析软件.[结果]DRA基因与其它物种核苷酸序列的同源性均在90％以上.进化树分析羊与牛在同一个分支上,亲缘关系最近.BoLA-DRA编码蛋白为疏水性蛋白,1个跨膜螺旋的膜蛋白,7个功能结构域,6个翻译后修饰位点.预测N末端包含信号肽序列,其切割位点位于26～27位的氨基酸之间.亚细胞定位该蛋白定位在细胞膜上,由α螺旋结构,β折叠结构、β转角结构和无规则卷曲结构形成二级结构.[结论]本试验初步获得了BoLA-DRA编码蛋白区生物信息学分析数据. 相似文献
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本研究旨在进行猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列（登录号：NM_214277）相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。 相似文献
6.
研究采用生物信息学方法分析了猪MBL2基因,进一步获得猪MBL2基因序列特征及编码蛋白的结构和功能,并且对CDS区里的编码蛋白的理化性质进行了预测。除此之外还对这些编码蛋白是亲水还是疏水、它们的糖基化位点、信号肽、二级结构以及三级结构进行了预测。实验结果表明,猪的MBL2基因的大小是723 bp,编码的氨基酸共有240个,蛋白质的相对分子质量为25 522.83 KDa,理论等电点PI为4.97。MBL2基因的二级结构是无规则的卷曲型,蛋白结构预测结果是一种可溶性蛋白,具有4个外显子;在第20-21位氨基酸之间存在信号肽,表现为亲水性。研究结果为进一步研究猪MBL2基因的功能提供了理论基础。 相似文献
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《甘肃畜牧兽医》2020,(6)
目的:本研究旨在对猪KCNJ13基因序列及其编码的蛋白结构和功能进行预测分析。方法:通过用生物信息学软件对猪KCNJ13基因序列特征、氨基酸同源性、亚细胞定位、二级结构、蛋白保守结构域、跨膜结构域进行预测分析。结果表明:猪KCNJ13基因序列中存在1 083 bp的开放阅读框,编码360个氨基酸,与人、犬、海豚、黑猩猩、马的亲缘关系较近;该基因编码的蛋白为跨膜蛋白,结构较稳定,分子量为40 455.60,理论等电点为5.76;二级结构以无规卷曲为主,主要定位于线粒体和内质网。结论:上述结果推断该蛋白具有重要生物学意义,该研究可为进一步揭示猪KCNJ13基因生物学功能奠定基础。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒细胞受体研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒主要引起仔猪腹泻,发病率及病死率极高,严重影响养猪业的发展。而猪流行性腹泻病毒要感染仔猪,必须与宿主细胞表面的受体结合。目前已有研究证实,猪流行性腹泻病毒的细胞表面受体为猪氨基肽酶N(pAPN)。为了能更好的揭示pAPN在病毒感染过程中的机制,学者针对pAPN的结构、功能以及与病毒的感染结合区域进行了系统的研究,并开展了筛选pAPN结合短肽的工作,以此来探索病毒受体的阻断剂。为进一步研究猪流行性腹泻病毒感染机制及其细胞受体的作用提供参考,论文就目前pAPN最新研究进展进行了综述。 相似文献
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为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。 相似文献
10.
为分析猪葡萄球菌脱落毒素EXHC和SHETA基因结构并预测其所编码蛋白的结构和功能,本试验根据GenBank已报道的猪葡萄球菌脱落毒素EXHC和SHETA基因序列分别设计了1对特异性引物,从猪葡萄球菌GDZC株中扩增获得EXHC和SHETA基因片段,大小分别为1007和971 bp。序列分析结果表明,EXHC基因与猪葡萄球菌丹麦分离株(GenBank登录号:AF515455)及猪源松鼠葡萄球菌河北分离株(GenBank登录号:JF755400)的核苷酸序列、氨基酸序列同源性均为100.0%,而与其他葡萄球菌脱落毒素基因的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为3.3%~53.9%和7.9%~44.2%。SHETA基因与日本分离株(GenBank登录号:AB036768)的核苷酸序列同源性为96.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,在保守区共有31个碱基发生突变。利用DNAStar软件对EXHC和SHETA蛋白结构进行分析,结果显示EXHC基因编码的蛋白为亲水性蛋白,SHETA基因编码蛋白为疏水性蛋白,抗原性较差。本研究从猪葡萄球菌GDZC株中成功扩增获得EXHC和SHETA基因片段并对其编码的蛋白结构进行了预测,证实了中国分离的猪葡萄球菌同时携带有EXHC和SHETA 2种毒素基因,为进一步研究猪葡萄球菌的致病机理及毒素之间的相互作用提供了理论依据。 相似文献
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副猪嗜血杆菌广东分离株外膜蛋白P5基因的克隆及蛋白结构预测 总被引：3，自引：1，他引：2
根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从广东省HPS分离株外膜蛋白P5基因中扩增出与预期设计的1116bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,克隆出HPS广东分离株的目的基因,核苷酸长为1116bp,共编码371个氨基酸,与已发表的HPS(SH0165)外膜蛋白基因核苷酸序列同源性100%,氨基酸同源性100%。生物学预测分析结果显示,HPS外膜蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,其β-转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位;其N端含有1个信号肽,最佳切割位点在21～22个氨基酸;有15个抗原决定簇;无跨膜区;同源建模分析,未见相似三维结构。 相似文献
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试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C3189H5153N865O1019S13。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。 相似文献
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试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase,PFKL）基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C3674H5897N1051O1109S40。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。 相似文献
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ZHU Shi-kang TONG Tie-zhu LIU Xing LI Chun-ping CHEN Yan-zhong LUO Zhuo-jun LIN Zhi-xiong LIU Zhong-yong ZHOU Yu 《中国畜牧兽医》2017,44(1):186-193
The glycoproteins B (gB) gene of porcine lymphotropic herpesviruses 2 (PLHV-2)was amplified by PCR and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted. The gB protein was composed of 876 amino acids, the molecular formula was C4500H6975N1199O1351S40, the molecular mass was 100.77 ku, the value of theoretical isoelectric point was 6.45, and the instability index was 38.58. The prediction of secondary structure revealed that some alpha helixes and beta sheets exist in protein while random coil was major pattern. It had a signal peptide in the position 1-39 amino acids and a transmembrane helice in the position 761-780 amino acids. It contained several prosites and several intrinsically disordered proteins. Tertiary structure model of gB protein showed a fusion loop. Multiple antigenic epitope located in gB through comprehensive analysis prediction method. It was suggested that gB gene could be as a candidate antigen for vaccination of PLHV-2. 相似文献
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试验采用PCR方法扩增出猪嗜淋巴细胞疱疹病毒2型（porcine lymphotropic herpesviruses 2,PLHV-2）gB基因全序列,并进行测序,使用生物信息学软件对gB蛋白进行生物信息学分析和预测。结果显示,gB蛋白由876个氨基酸组成,分子式为C4500H6975N1199O1351S40,分子质量为100.77 ku,等电点为6.45,不稳定系数为38.58;二级结构预测以无规则卷曲为主要结构,1-39位氨基酸为信号肽,761-780位氨基酸为跨膜区结构,具有多种功能位点,存在多处天然非规则结构蛋白;三级结构显示有一个具有溶解作用的环状构象。综合多种方法分析预测结果表明,gB基因存在多个B细胞线性抗原表位,可作为PLHV-2疫苗的候选抗原。 相似文献
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以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料,用RNA提取试剂盒抽提总RNA,通过RT-PCR技术和DNA序列测定分析,证实获得了拟南芥高亲和性K+载体蛋白基因(AtHKT1)的cDNA序列。该cDNA全长1521 bp,包括506个氨基酸和1个终止密码子序列,且与原序列(accession number AF237672)同源性为99.34%,但与其他科植物HKT1基因同源性较低,注册该基因到GenBank中,注册号为AY685182。利用生物信息学相关软件分析预测AtHKT1基因蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白分子量为57.45 kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1～40个氨基酸属信号肽序列;第152～500个氨基酸属Trk H阳离子转运体蛋白保守结构域,并存在蛋白激酶C,酪氨酸蛋白激酶,依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化,糖基化和豆蔻酰化等功能位点;该基因编码的蛋白有10个跨膜结构,N末端、C末端及中部等多个跨膜区具疏水性,符合载体类运输蛋白特点。表明本研究获得了拟南芥AtHKT1基因。 相似文献
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对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。 相似文献
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ZHANG Hao ZHAO Jia-ping WU Qiong YANG Ying DU Zhan-yu GUO Yue-yue XING Xiu-mei XU Chao ZHANG Lin-bo 《中国畜牧兽医》2016,43(10):2527-2533
To in-depth analyze the molecular structure characteristics of agouti gene,using bioinformatic methods for RNA-Seqs test to get the complete coding sequence of raccoon dog agouti gene,and its coding protein structure was forecasted and analyzed.The results showed that the length of raccoon dog agouti gene cDNA was 530 bp which contained 396 bp open reading frame (ORF),encoded 131 amino acids.Predicting the weight of the raccoon dog agouti protein molecular was 14.41 ku and isoelectric point (pI) was 9.68,as the unstable hydrophohbic protein;It contained 11 phosphorylation sites,1 glycosylation sites and a long reach 24 amino acid signal peptide;Random coil was the main secondary structure.Phylogenetic tree showed that the raccoon dog had a close genetics distance to vuipe and canis familiaris which was consistent with the traditional animal taxonomy.Through the analysis of the molecular structure characteristics of raccoon dog agouti gene,to provide the oretical basis for revealing the influence of the colour diversity molecular genetics mechanism. 相似文献